颜赛娜，杨岸奇，唐湘薇，陈楚杰，尹艳飞，向娇娇，马佳佳，冉茂良*，陈斌*

(1. 湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 畜禽遗传改良湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

支持细胞(Sertoli cells)分布于睾丸曲细精管上皮细胞管壁上偏基膜侧，在睾丸细胞中体积最大且形状不均匀[1]。该细胞最明显特征是可以通过分泌缪勒管激素抑制因子(mullerian inhibiting factor)，在胚胎确定为雄性后阻碍雌性器官发育[2]。此外，支持细胞具有分泌抑制素B(inhibin b)、活化素(activin)、雄激素结合蛋白(androgen binding protein，ABP)的功能[3-5]，这些物质对于睾丸发育和性成熟具有重要作用。睾丸中每个成熟的支持细胞可以为30～50个生殖细胞提供营养支持[6]。哺乳动物睾丸体积大小及产生精子能力与睾丸支持细胞的数量呈正相关[7]。成熟的支持细胞不具备增殖能力，在成熟睾丸中数量相对稳定[8]，其最终数量取决于未成熟时的增殖活性。说明睾丸未成熟支持细胞的增殖活性对种公畜繁殖性能和养殖效益具有重要影响。

未成熟支持细胞的增殖受到激素、信号通路、基因等多方面的调控。本课题组前期研究鉴定出在睾丸发育过程中受3′UTR甲基化水平正向调控的枢纽基因，如INHBA(inhibin subunit beta A)、SMAD6和TGFB3(transforming growth factor beta 3)等，其中INHBA基因已被验证能影响支持细胞增殖活性[9]。但SMAD6在睾丸发育过程中的生物学功能尚未被发掘。因此，本研究旨在探明SMAD6对猪未成熟支持细胞增殖及凋亡的影响，为睾丸发育和精子生成中的分子调控作用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

猪睾丸细胞系(ST)ATCC®CRL-1746TM购自上海安为生物科技有限公司，已证实为纯度接近100%的猪未成熟支持细胞[10]，并已应用于相关研究[11-12]。细胞完全培养基为：高糖DMEM∶胎牛血清∶双抗(Penicillin-Streptomycin)=10∶1∶0.1，各成分均来自美国Gibco公司。细胞培养条件为：在有一定湿度、温度为37 ℃及含5% CO2的细胞培养箱中培养。

1.2 SMAD6过表达载体构建和SMAD6干扰RNA合成

SMAD6过表达质粒(OE-SMAD6)以NheⅠ和KpnⅠ为酶切位点、以pcDNA3.1(+)-EGFP为载体(氨苄抗性)在武汉金开瑞生物工程有限公司设计并合成。SMAD6干扰RNA(SMAD6 siRNA)由广州锐博生物技术有限公司设计并合成，干扰序列见表1。

表1 SMAD6 siRNA序列

1.3 细胞转染

细胞接种于6孔板中，融合度达60%～80%时，吸弃完全培养基，每孔加入1 mL的PBS润洗2遍；向每孔加入1 mL不含血清和双抗的高糖DMEM，培养箱中继续培养2 h。OE-SMAD6组和对照组(NC)每孔准备2管125 μL的DMEM，一管加入9 μL Lipofectamine®2000(美国Invitrogen公司)，另一管分别加入OE-SMAD6和pcDNA3.1(+)-EGFP空载(NC)质粒，2管分别充分混匀后，室温静置5 min；将2管试剂混合成1管并充分混匀，室温静置30 min后加入细胞培养液中。干扰SMAD6表达组和对照组每孔准备1管120 μL的DMEM，分别加入5 μL的SMAD6 siRNA和siRNA NC，充分混匀后室温静置5 min；加入12 μL Lipofectamine®2000，充分混匀，室温静置30 min后加入细胞培养液中。以上每组设置3个重复，每个重复1个孔，转染培养6 h后更换为完全培养基，继续培养至一定状态后进行后续试验。

1.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

细胞在6孔板中转染后继续培养24 h，采用TRIzol(美国Thermo公司)提取细胞总RNA，核酸/蛋白浓度测定仪(Nan Drop ND-2000，美国Themo Scientific公司)测定RNA浓度并检测总RNA质量；使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(日本TaKaRa公司)进行逆转录获得cDNA；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息见表2。使用SYBR®PremixExTaqTMⅡ试剂盒(日本TaKaRa公司)进行RT-qPCR；配制RT-qPCR反应液，反应体系为：7.5 μL TB-GreenⅡ®PremixExTaqTM(2×)、0.6 μL上游引物、0.6 μL下游引物、1 μL cDNA和5.3 μL ddH2O；CFX Connect实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)上进行RT-qPCR反应，反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39次循环；95 ℃ 10 s；65～95 ℃ 每0.5 ℃进行1次荧光监测。ACTB为内参基因，每个样品设置3个重复孔。采用2-ΔΔCt公式计算基因的相对表达水平。

表2 引物信息

1.5 细胞增殖检测

细胞转染后按照CCK-8试剂盒和EdU试剂盒(上海百赛生物技术股份有限公司)说明书操作，接种于96孔板，检测细胞增殖情况。CCK-8检测：分别于0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱孵育4 h，在450 nm波长下检测每孔细胞的吸光度值，以0 h作为对照，计算24、48、72 h各组细胞的相对增殖率。EdU检测：96孔板培养24 h后，每孔加入50 μmol/L EdU试剂100 μL，置于培养箱孵育2 h，按照EdU试剂盒使用说明书进行细胞固定、Apollo染色和DNA染色，随后荧光显微镜下拍照。

1.6 细胞ATP水平测定

细胞在6孔板中转染后继续培养24 h，吸弃培养基，1 mL PBS清洗2次，每孔加入200 μL ATP试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)中的ATP裂解液，冰上裂解5 min，收集裂解产物，4 ℃、15 000 r/min离心5 min，后续按试剂盒说明书进行操作。

1.7 流式细胞凋亡检测

细胞在6孔板中转染后继续培养12～24 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞沉淀于1.5 mL离心管中；使用Annexin V-Alexa Flour 647/PI Kit凋亡检测试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)对细胞沉淀进行染色：Binding Buffer、Annexin V-FITC和Propidium Iodide按比例混合，每管细胞沉淀加入200 μL混合液，涡旋混匀，室温下避光孵育20 min；流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 Western blot检测

细胞在6孔板中转染后继续培养48 h，收集细胞；加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)裂解细胞获取蛋白；用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度；蛋白样品变性后按照12 μg每孔加入10%的SDS-PAGE凝胶[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]中进行电泳；200 mA转膜1 h；PVDF膜置于孵育盒中，加入10 mL快速封闭液(上海碧云天生物技术有限公司)封闭30 min；去除封闭液，加入10 mL一抗室温孵育2 h，4 ℃孵育过夜，一抗包括：β-actin(1∶2 000，美国Proteintech Group公司)，SMAD6(1∶500，北京博奥森生物技术有限公司)，BAX(1∶1 000，美国Proteintech Group公司)，Caspase3(1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司)；回收一抗，加入10 mL二抗室温孵育2～4 h，二抗包括辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶1 000，上海碧云天生物技术有限公司)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，上海碧云天生物技术有限公司)；去除二抗，ECL化学发光液(成都正能生物技术有限责任公司)孵育PVDF膜1 min后进行显影。

1.9 数据统计分析

所有试验中每个处理组各3个生物重复，即统计结果的每组样本数为3。Image J软件进行细胞计数；IBM SPSS Statistics 25进行统计分析，显著性差异分析用t检验，数据以“均值±标准差”形式表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 OE-SMAD6和SMAD6 siRNA的转染效果

为确定OE-SMAD6的转染量和SMAD6 siRNA的转染序列，分别将不同含量的OE-SMAD6、NC、3条不同序列的SMAD6 siRNA和siRNA NC转染至猪未成熟支持细胞中，采用荧光激发观察OE-SMAD6转染情况，结果显示，3 000 ng OE-SMAD6组中有较强荧光(图1A)；采用RT-qPCR检测SMAD6表达情况，结果显示，3 000 ng OE-SMAD6的SMAD6相对表达量较高且极显著高于NC组(P<0.01)(图1B)，SMAD6 siRNA-1组的SMAD6相对表达量最低且极显著低于siRNA NC组(P<0.01)(图1C)；采用Western blot检测SMAD6蛋白的表达情况，结果显示，3 000 ng OE-SMAD6组的SMAD6蛋白相对表达量显著高于NC组(P<0.05)(图1D)，SMAD6 siRNA-1组的SMAD6蛋白相对表达量极显著低于siRNA NC组(P<0.01)(图1E)。以上结果表明，转染3 000 ng OE-SMAD6和SMAD6 siRNA-1后有效影响了猪未成熟支持细胞中SMAD6的表达，后续试验将选择3 000 ng作为OE-SMAD6的转染量，选择SMAD6 siRNA-1进行SMAD6 siRNA的转染。

A. 转染不同含量OE-SMAD6后细胞荧光图(绿色为OE-SMAD6载体上EGFP在细胞内的表达，标尺=100 μm)；

2.2 SMAD6促进猪未成熟支持细胞的增殖

为明确SMAD6对进猪未成熟支持细胞增殖的作用，在猪未成熟支持细胞中分别过表达SMAD6和干扰SMAD6的表达后检测细胞增殖情况。采用RT-qPCR检测周期相关基因(CCND1、CCNE1、CDK4和MYC)和增殖相关基因(EGF、FGF2、PCNA、和GDNF)的表达，结果显示，过表达SMAD6后周期相关基因和增殖相关基因的相对表达水平均显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)(图2A和B)，干扰SMAD6的表达后周期相关基因和增殖相关基因的相对表达水平均极显著降低(P<0.01)(图2C和D)；用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况，结果显示，转染OE-SMAD6后24 h时细胞增殖活性显著升高(P<0.05)，转染OE-SMAD6后48 h时极显著升高(P<0.01)(图2E)，转染SMAD6 siRNA后48 h和72 h时细胞增殖活性均极显著下降(P<0.01)(图2F)；用EdU试剂盒对细胞进行染色，结果显示，过表达SMAD6后EdU阳性细胞率极显著升高(P<0.01)(图2G)，干扰SMAD6的表达后EdU阳性细胞率则极显著下降(P<0.01)(图2H)。以上结果表明，SMAD6有促进猪未成熟支持细胞增殖的作用。

A、B. 转染OE-SMAD6，RT-qPCR检测细胞周期相关基因和增殖相关基因的相对表达量；C、D. 转染SMAD6 siRNA，RT-qPCR检测细胞周期相关基因和增殖相关基因的相对表达量；E、F. 分别转染OE-SMAD6和SMAD6 siRNA，CCK-8试剂盒检测细胞增殖倍数；G、H. 分别转染OE-SMAD6 和SMAD6 siRNA 24 h后，EdU试剂盒检测细胞增殖情况及统计结果(标尺=1 000 μm)。

2.3 SMAD6抑制猪未成熟支持细胞的凋亡

为明确SMAD6对进猪未成熟支持细胞凋亡的作用，在猪未成熟支持细胞中分别过表达SMAD6和干扰SMAD6的表达后检测细胞凋亡情况。采用ATP检测试剂盒测定细胞ATP水平，结果显示，过表达SMAD6后细胞ATP水平极显著升高(P<0.01)(图3A)，干扰SMAD6的表达后细胞ATP水平则极显著下降(P<0.01)(图3B)；采用Western blot检测促凋亡相关蛋白BAX和Caspase3的表达水平，结果的显示，过表达SMAD6后BAX的表达显著降低(P<0.05)，Caspase3的表达有所降低但不显著(P=0.08)(图3C)，干扰SMAD6表达后BAX和Caspase3的表达均显著升高(P<0.05)(图3D)；用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示，过表达SMAD6后细胞凋亡率显著下降(P<0.05)(图3E)，干扰SMAD6表达后细胞凋亡率则显著上升(P<0.05)(图3F)。以上结果表明，SMAD6有抑制猪未成熟支持细胞凋亡的作用。

A、B. 分别为转染OE-SMAD6和SMAD6 siRNA后细胞ATP水平；

3 讨论

SMAD家族蛋白是由一系列SMAD家族基因编码且结构类似的功能性蛋白，主要作用为将TGF-β信号由细胞表面受体传导至细胞核内[13]。SMAD蛋白主要分为3类：①由SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8和SMAD9组成的通路限制性或受体活化型SMAD(R-SMAD)，其中SMAD2和SMAD3由TGF-β信号激活又称为AR-SMAD，而其他R-SMAD由BMP(bone morphogenetic protein)信号激活可归类为BR-SMAD[14]；②共同通路型SMAD(Co-SMAD)，目前已知的Co-SMAD仅包括SMAD4，主要作用为与R-SMAD共同招募调节因子，也是各类TGF-β家族信号传导所必需的共同介质[15]；③由SMAD6和SMAD7组成的抑制性SMAD(I-SMAD)[16]。 I-SMAD可以通过多种途径以破坏TGF-β/BMP信号传统，如I-SMAD保守MH2结构域与1型受体结合而减少R-SMAD对上游信号的传导，或者与激活的R-SMAD形成异构复合物而抑制R-SMAD与Co-SMAD结合；另外I-SMAD还可以通过招募泛素连接酶以靶向降解激活的R-SMAD[17]。SMAD7能对各类TGF-β信号起到抑制作用，SMAD6则主要是对BMP信号进行抑制进而影响体内多种细胞的增殖、分化与凋亡[18]。

众多研究表明，SMAD6对细胞增殖有重要影响。Wang等[19]的研究表明，与正常细胞相比，视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)中SMAD6基因表达量显著上调，但通过干扰BR细胞中SMAD6后发现BR细胞的增殖速度显著降低。Lu等[20]发现在前列腺癌中HNF1B基因可以直接抑制SMAD6表达进而抑制细胞周期蛋白D1，造成癌细胞增殖速度下降。Wang等[21]使用BMP抑制剂LDN-193189 (LDN)处理胚胎生殖细胞后，细胞中SMAD6基因的表达被完全抑制，并且细胞停滞在有丝分裂期。以上研究说明SMAD6对某些细胞的增殖具有促进作用。本研究也出现类似的结果，在体外培养的猪未成熟细胞中分别过表达SMAD6和干扰SMAD6表达后检测细胞增殖情况，发现SMAD6对猪未成熟支持细胞的增殖有正向促进作用。

SMAD6对细胞凋亡有重要影响。Jeon等[22]研究表明，SMAD6的敲低激活了c-Jun NH2末端激酶途径并减少了Rb-1的磷酸化，导致肺癌细胞系H1299凋亡增加。Wu等[23]研究发现，miR-186靶向SMAD6通过丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)激活诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的凋亡。Xu等[24]同样研究发现，SMAD6作为miR-186的靶标其表达受到抑制而促进胶质瘤U87细胞的凋亡。上述研究结果表明，SMAD6对某些细胞的凋亡具有抑制作用。本研究结果也与之一致，即在体外培养的猪未成熟细胞中分别过表达SMAD6和干扰SMAD6表达后检测细胞凋亡情况，发现SMAD6对猪未成熟支持细胞的凋亡有抑制作用。