程彦茗，范阳，毛胜勇，丁立人

(南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095)

随着我国反刍动物产业的快速发展，养殖业对粗饲料资源的需求量不断增大[1]。当前，尽管我国一些现有的粗饲料资源如花生秸秆等已得到充分利用，但仍不能满足产业需求，急需新开发有稳定来源的粗饲料资源[2]。稻壳粉是水稻加工的主要副产物(占水稻重量的20%以上)，是一类常见的非常规饲料资源。据报道，我国每年约产4 000多万吨稻壳粉[3]，可利用资源十分丰富。但在实际生产中，稻壳粉中纤维素类物质约占63.67%，较高的木质纤维素影响了机体对其他营养物质的消化吸收。有研究报道，如果将稻壳粉作为饲料来源直接饲喂家畜，其消化率仅为5%～8%[4]。近年来一些研究发现，使用微生物发酵技术有助于提高稻壳粉的利用率[5]。Aderolu等[6]研究表明，使用绿色木霉菌(Trichodermaviride)处理稻壳粉40 d后，与发酵前相比，稻壳粉的代谢能和粗蛋白的含量显著上升，而粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的含量显著降低。Beg等[7]研究表明，使用糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)处理稻壳，与发酵原料相比，发酵稻壳粉的粗蛋白含量从2.15%增加到了9.3%，且消化率也上升了14.76%，而粗纤维、纤维素和木质素的含量分别减少了35.4%、19.7%和40.9%。然而，以前有关稻壳粉的研究多采用霉菌等真菌进行发酵，由于这些霉菌未列入饲料添加剂目录，因而以这些微生物发酵生产稻壳粉存在潜在的饲料安全问题。乳酸菌、酵母菌、芽胞杆菌是饲料微生物目录中的常见菌株，是否可以采用这些菌联合发酵稻壳粉，并提高其饲料营养价值，目前并不清楚。

本试验利用实验室保存的3株菌，即植物乳杆菌L1(Lactobacillusplantarum)、枯草芽胞杆菌B6(Bacillussubtilis)和酿酒酵母菌S2(Saccharomycescerevisiae)混合发酵稻壳粉饲料，研究了稻壳粉发酵饲料在制作过程中的相关参数，最终筛选出发酵所需的最佳菌种比例和发酵条件，拟为发酵稻壳粉饲料的生产提供理论指导，为我国开发新型粗饲料资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

因稻壳粉营养成分含量较低，故添加玉米粉与豆粕粉作为发酵底物为菌种生长与动物饲喂提供营养，稻壳粉、玉米粉和豆粕粉三者重量比例为16∶3∶1，发酵底物由安徽大北农农牧科技有限公司提供。为促进微生物生长，将发酵底物的含水量调整至35%。发酵所用菌种为南京农业大学消化道微生物实验室保存的植物乳杆菌L1、枯草芽胞杆菌B6和酿酒酵母菌S2。试验所用的培养基购自南京丁贝生物科技有限公司。

1.2 发酵菌液的制备

按0.1%(体积比)接种量将冻存的植物乳杆菌、枯草芽胞杆菌和酿酒酵母菌分别接种于对应的无菌液体培养基中，用MRS培养基活化植物乳杆菌，用LB培养基活化枯草芽胞杆菌，用YPD培养基活化酿酒酵母菌。将植物乳杆菌置于37 ℃恒温箱静置培养24 h，枯草芽胞杆菌置于37 ℃、140 r/min 摇床振荡培养24 h，酿酒酵母菌置于30 ℃、140 r/min 摇床振荡培养24 h。用接种环取少量菌液通过平板涂布法接种到无菌固体培养基中，培养24 h后挑取单菌落接种到灭菌后的液体培养基中，制成发酵菌液并测定各菌液的活菌数，活菌数>5lg CFU/g即可用于饲料发酵(植物乳杆菌活菌数>7lg CFU/g，枯草芽胞杆菌活菌数>6lg CFU/g，酿酒酵母菌活菌数>6lg CFU/g)。

1.3 固态发酵

取500 g固态发酵底物置于带有单向透气阀的聚乙烯袋中(规格为 300 mm×200 mm)，将发酵菌液按照不同的组合和接种量接种到固态发酵底物中，搅拌均匀并在发酵袋中留存部分空气后封口，置于恒温培养箱培养。

1.4 发酵稻壳粉菌种比例优化

采用L9(33)正交试验设计，将各菌种按3个接种比例进行三因素三水平正交试验，每个水平3个重复。按5%的接种量进行发酵底物的接种，接种后，于35 ℃固体发酵(自然pH值)5 d，测定发酵饲料pH值、乳酸菌活菌数、芽胞杆菌活菌数、酵母菌活菌数、乳酸浓度、挥发性脂肪酸浓度、纤维素、半纤维素和酸性洗涤木质素含量，上述指标经过Topsis(优劣解距离法)计算后，确定发酵稻壳粉饲料的最佳菌种组合。发酵稻壳粉饲料菌种组合的正交试验设计见表1。

表1 发酵稻壳粉饲料菌种组合的正交试验设计

1.5 发酵稻壳粉饲料的工艺优化

在确定3个菌种最佳接种配比之后，采用L9(33)正交试验设计，将接种量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)3个因素进行优化，每个因素设3个水平，进行三因素三水平的正交试验(表2)，每个水平3个重复，将上述发酵指标含量经过Topsis计算，确定发酵稻壳粉饲料的最佳条件。稻壳粉饲料的发酵条件优化的正交试验设计见表2。

表2 稻壳粉饲料发酵条件优化的正交试验设计

1.6 相关指标的测定

1.6.1 活菌数

在无菌条件下从各个处理组取1 g发酵产物置于灭菌后的离心管中，加入9 mL 0.9%无菌生理盐水，混合均匀，置于4 ℃冰箱过夜，之后用稀释涂布平板法测定3种菌株活菌数；用MRS 培养基测定乳酸菌数量、LB 培养基测定芽胞杆菌数量、YPD 培养基测定酵母菌数量。具体方法参照文献[8]。

1.6.2 发酵指标

开袋后将发酵产物混匀，从各个处理组取2 g发酵产物置于离心管，加入2 mL超纯水后静置于4 ℃冰箱保存过夜，提取浸提液，用HI-9024C便携式pH计(HANNA Instruments，美国)测定其pH值；取1 g饲料加入9 mL超纯水混合均匀置于4 ℃冰箱过夜后，取上清液，采用气相色谱法(GC-14B，岛津，日本)测定其挥发性脂肪酸的含量[9]，并取上述上清液采用乳酸试剂盒(南京建成生物科技有限公司，南京)测定其乳酸的含量。

1.6.3 营养成分含量

从各个处理组取5 g发酵产物置于烘箱，105 ℃烘干至恒重后回潮，用于测定纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素等饲料常规养分，具体方法参照文献[10]。纤维素含量的测定使用ANKOM-A200i自动纤维分析仪(美国)，粗灰分含量的测定使用一恒箱式电阻炉SX2-4-10N(中国)，粗蛋白含量的测定使用FOSS凯氏定氮仪2300(丹麦)，粗脂肪含量的测定使用索氏提取仪。

1.7 数据统计和分析

试验数据采用Excel(2020)进行初步整理，使用SPSS 26.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用SNK(Student-Newman-Keuls)法进行多重比较检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。采用DPS数据处理系统中的Topsis法对发酵后的pH值、活菌数、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素分别赋予-2、2、1、1、1、-1、-1、-1、-1的权重后计算评分。

2 结果与分析

2.1 发酵稻壳粉的菌种组合优化

2.1.1 不同菌种组合对发酵稻壳粉饲料中微生物数量的影响

由表3可知，试验8、9组的乳酸菌数量极显著高于其他组(P<0.01)，试验5、7、8、9组的芽胞杆菌和酵母菌数量极显著高于其他组(P<0.01)。

表3 不同菌种组合对发酵稻壳粉饲料中微生物数量的影响 lg CFU/g

2.1.2 不同菌种组合对发酵稻壳粉饲料的酸度、挥发性脂肪酸浓度和纤维素含量的影响

由表4可知，9个试验组的pH值均小于4.5，其中第8组的pH值最低为4.39，但差异不显著(P>0.05)；第3组的乳酸含量最高，为35.45 μmol/g，显著高于第2、6、7、9组(P<0.05)；第1组的乙酸含量极显著高于第5、8、9组(P<0.01)；第3组的丙酸含量极显著高于第7、8、9组(P<0.01)；各组均检测到少量的丁酸，其中第6组的丁酸含量最低，为0.18 μmol/g，极显著低于第3、8、9组(P<0.01)；第1组的纤维素含量最低，为36.19%；第9组的半纤维素含量最低，为19.36%；第4组的酸性洗涤木质素最低，为6.76%，极显著低于第1组(P<0.01)。

表4 不同菌种组合对发酵稻壳粉饲料的酸度、挥发性脂肪酸浓度和纤维素含量的影响

2.1.3 不同菌种比例的Topsis综合评分

采用Topsis法对上述结果综合多指标分析，表5结果显示第2组得分最高，为0.611 8。因此，接种比例的最佳组合为第2组，即植物乳杆菌∶枯草芽胞杆菌∶酿酒酵母菌=1∶2∶2。

表5 不同菌种比例的Topsis综合评分法结果

2.2 发酵稻壳粉发酵条件的优化

2.2.1 不同发酵条件对发酵稻壳粉饲料中微生物数量的影响

由表6可知，试验1组(接种量为3%，发酵时间为48 h，发酵温度为25 ℃)的乳酸菌、芽胞杆菌和酵母菌数量均显著高于其他组(P<0.001)，其中乳酸菌数量比最低组高57.73%，芽胞杆菌菌数量比最低组高46.35%，酵母菌数量比最低组高50.00%。

表6 不同发酵工艺条件对发酵稻壳粉饲料中微生物数量的影响 lg CFU/g

2.2.2 不同发酵条件对发酵稻壳粉饲料酸度、挥发性脂肪酸浓度和纤维素含量的影响

由表7可知，第2组pH值最低，为3.81，极显著低于第1、6、9组(P<0.01)；第7组乳酸最高，为40.51 μmol/g，极显著高于第1、6、9组(P<0.01)；第9组的乙酸含量最高，为44.70 μmol/g，显著高于第1、3、4、7组(P<0.05)；第6组的丙酸含量最高，为6.62 μmol/g；第7组的丁酸含量最低，为0.84 μmol/g；第3组的纤维素和半纤维素含量最低；第4组的酸性洗涤木质素含量最低，为15.43%。

表7 不同发酵工艺条件对发酵稻壳粉饲料酸度、挥发性脂肪酸浓度和纤维素的含量的影响

2.2.3 不同发酵条件的Topsis综合评分

采用Topsis法对上述结果进行多指标综合分析，表8结果显示，第9组得分最高，为0.640 8。因此混合发酵稻壳粉工艺条件的最佳组合为第9组，即接种7%的菌液并在25 ℃的条件下发酵96 h。

表8 不同发酵工艺组合Topsis综合评分法结果

2.3 发酵后稻壳粉饲料pH值及营养成分含量变化

按照筛选出的工艺参数发酵稻壳粉饲料，与发酵前稻壳粉进行pH值及营养水平变化比较，每组4个重复，结果如表9所示。发酵前后稻壳粉干物质含量、粗蛋白、粗灰分、粗纤维、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量没有显著差异(P>0.05)，pH值较发酵前极显著下降(P<0.01)，酸溶蛋白和粗脂肪的含量均极显著升高(P<0.01)。

表9 发酵后稻壳粉饲料pH值及营养成分含量变化(占干物质)

3 讨论

我国稻壳粉产量丰富，但由于其纤维含量高且适口性差，较少在畜牧生产中使用。有研究表明，微生物发酵可以提高饲料的适口性并改善其营养成分。本试验发现，稻壳粉发酵后，其发酵产物质地松散似砂砾，气味酸香，结果表明，复合菌发酵可以改善稻壳粉饲料的感官品质。曲强[11]研究表明，发酵产生风味物质有助于改善菌糠饲料的适口性，增加动物食欲并提高采食量，显著促进了育成羊的增重。因此，可推测发酵稻壳粉有利于提升动物的采食量。

单菌发酵和复合菌发酵是常见的2种生产发酵饲料模式。单菌种发酵是采用单一菌种进行发酵，大多使用乳酸菌，发酵条件与复合菌发酵相比，简单可控，成本更低；而复合菌发酵是充分利用各菌种的协同发酵作用。有研究表明，复合菌发酵的交互作用使微生物代谢产物的营养成分要优于单菌发酵的结果[12]，在发酵饲料生产中使用枯草芽胞杆菌和酿酒酵母菌，不仅可将饲料中大分子物质转化为小分子，还在发酵过程中消耗空气，使饲料更快进入厌氧发酵阶段，加快了植物乳杆菌生长代谢的速度，从而生成大量乳酸[13]。植物乳杆菌、枯草芽胞杆菌和酿酒酵母菌3株菌之间没有拮抗作用，是用于共同发酵的常见菌株[14]，因此本试验采用这3株菌对稻壳粉饲料进行发酵。本试验发酵最佳组第9组的乳酸菌、芽胞杆菌和酵母菌活菌数均达到7.62 lg CFU/g 以上，说明3株菌在发酵底物上生长较好，而第2次发酵中的第2、3、6组活菌数含量较低，可能是饲料在发酵过程中产热导致温度超出环境温度，达不到复合菌种生长的适宜温度，且在较高温度下，长时间发酵加速了菌种的衰亡。

研究表明，乳酸不仅可提高饲料适口性，还降低饲料pH值，进而抑制有害菌的生长，也提高饲料的有氧稳定性[15-16]。本试验发酵最佳组第9组乳酸含量为29.23 μmol/g，说明饲料发酵较为充分。有研究表明，优质饲料的pH值一般为3.8～4.2[17]。本试验发酵最佳组第9组pH值为3.93，达到了优质发酵饲料标准，且比第1次发酵pH值下降较多，说明合适的菌种配比可以有效降低饲料的pH值。乙酸是一种有效的抑菌剂，对条件致病菌(如肠杆菌、埃希氏菌等)有抑制作用，并能有效提高干物质的回收率和水溶性化合物的含量，有利于有机成分的保存并提高饲料的储存性能[18-19]。本试验发酵最佳组第9组的乙酸含量为44.70 μmol/g，发酵品质较好。张相伦等[20]研究提出布氏乳杆菌可将乳酸分解为乙酸，所以乙酸含量的提高可能也与乳酸的分解有关。丁酸是一种具有刺激性气味的短链脂肪酸，有研究表明，丁酸的出现和梭菌代谢相关，梭菌可将糖类和乳酸等转化为丁酸，不仅造成了干物质损失，而且生成的不适气味会影响动物的采食[21]。本试验第9组中的丁酸含量为1.11 μmol/g，说明发酵过程良好。

Topsis是一种常见的决策分析方法，通过对指标赋予权重，归一后计算每个方案与理想方案几何距离从而进行排序筛选出最佳方案[22]。该试验选取发酵稻壳粉的pH值、活菌数、乳酸、挥发性脂肪酸、纤维素、半纤维素和酸性洗涤木质素的含量作为指标，分别根据其对饲喂动物的影响等赋予不同的权重，pH值在一定范围内降低更有利于动物采食消化；活菌数代表接种菌种生长状况；乳酸、乙酸和丙酸均为发酵优质产物；丁酸、纤维素、半纤维素和酸性洗涤木质素则对动物采食或消化饲料产生一定的负面影响，由此设置各个指标的权重，最终筛选出最佳的菌种配比和发酵条件。

发酵饲料营养成分的变化主要源于益生菌生长过程中对底物的降解和代谢产物的生成。朱晓峰等[23]研究表明乳酸杆菌固态发酵能降低菜籽粕硫代葡萄糖苷含量，改善其营养价值。本试验结果表明，经过发酵后稻壳粉饲料的酸溶蛋白含量由7.74%上升到16.20%，提高了109.30%，可能是由于枯草芽胞杆菌将大分子蛋白质水解成少量氨基酸组成的小肽；粗脂肪的含量达到4.50%，提高了69.17%，粗蛋白的含量提高了0.94%，一部分是所加菌液中的培养基成分具有的营养物质导致的，发酵饲料干物质的损失造成的“浓缩效应”同样会使其含量上升；发酵前后稻壳粉的纤维素含量均未显著变化，可能是因为饲料有氧发酵时间较短，抑制了芽胞杆菌产生纤维酶的能力，或是枯草芽胞杆菌对不同种类的发酵底物作用有差异，而酸性洗涤纤维上升了2.67%，可能是由于益生菌生长消耗饲料中的有机物，造成一定的干物质损失导致的比例升高。

4 结论

本试验通过正交试验筛选了植物乳杆菌、枯草芽胞杆菌和酿酒酵母菌混合发酵稻壳粉饲料的最优工艺条件为：植物乳杆菌∶枯草芽胞杆菌∶酿酒酵母菌=1∶2∶2，接种量为7%，发酵温度为25 ℃，发酵时间为96 h。经过发酵的稻壳粉饲料pH值显著下降，酸溶蛋白和粗脂肪含量显著上升，在一定程度上提高了其营养价值，但其在生产中的具体应用效果还需进一步试验探究。