张妍,郭凯悦,关小米,刘丽雅,韩丽萍

子宫内膜异位症(endometriosis,EMs)是一种雌激素依赖的良性妇科疾病,是子宫内膜腺体和间质在子宫内膜外不同部位的生长,卵巢、输卵管、膀胱、乙状结肠和子宫肌层是最常见的发病部位[1]。EMs临床多有月经异常、痛经、性交痛等表现,若不及时干预,可导致患者不孕,严重影响其身心健康及生活质量[2]。关于EMs的病因中最被广泛接受的是Sampson的经血逆流学说[3]:子宫内膜组织随经血逆流至盆、腹腔,进而形成EMs病灶。目前,临床上主要采用手术对EMs患者进行治疗,但临床研究中发现,腹腔镜手术治疗的患者复发率较高,两年复发率在35%左右[4]。

外泌体是大小为 30～150 nm 的胞外囊泡,不同于直接从膜上分离出来的胞外囊泡,外泌体主要通过核内体途径形成,并可由多种类型的活细胞分泌,在血液、腹水、尿液、卵泡液、精液、羊水等体液中均可发现[5]。外泌体内包裹携带着miRNA、lncRNA和蛋白质等多种生物分子,能够保护其免受降解,在细胞间信息传递过程中发挥着重要作用。已有报道指出,外泌体与卵巢癌、宫颈癌等多种癌症相关[6-7]。本综述旨在总结目前EMs外泌体研究领域的最新进展,指出目前研究存在的局限性并分析进一步研究可能的方向,以期为EMs外泌体的相关研究及临床应用提供新的思路。

1 外泌体内容物与EMs

外泌体具有磷脂双分子层结构,其内包裹携带着多种生物分子,几乎所有哺乳动物的细胞都能分泌外泌体,外泌体内容物包括蛋白质、脂类物质、mRNAs、微小 RNA(microRNAs,miR)等,它们可以反映来源细胞的生物学特点[8-9]。外泌体发挥作用常常需要依赖其内携带的蛋白质和RNAs,影响靶细胞的功能,从而起到信息传递的作用。外泌体脂质膜结构具有稳定性,在体液中广泛分布,分泌后可被受体细胞快速吸收,且易获得、具有良好的生物相容性[10]。外泌体可通过自分泌、旁分泌、内分泌等方式调控受体细胞的表型以及功能[11],其可从血管中扩散至组织间的特性也为EMs患者出现盆腹腔以外的病灶提供了新的研究思路。同时,外泌体的纳米尺寸允许它们从血管中渗出并在组织中扩散发挥作用,因此其可以作为潜在的纳米载体用于临床相关疾病的治疗,也具有作为生物学标志物的潜能。近来,越来越多的研究者将关注点放在了外泌体在EMs发生发展中的作用机制及其临床应用的研究上。

1.1 外泌体蛋白质与EMs

EMs的发生发展与蛋白质的作用存在关联,研究发现EMs病灶中高表达的蛋白质可促进EMs的进展[12-13]。外泌体可包裹携带蛋白质,保护其不被血液或组织中的蛋白酶降解,因此能保留蛋白质的生物学功能,将其携带至受体细胞并发挥其作用。Nazri等[14]的研究在EMs患者的腹腔液外泌体中检测出对照组患者缺乏的五类蛋白质:PRDX1、2-C H2A型、ANXA2、ITIH4和微管蛋白a链,开创性地提出了“腹腔液外泌体可作为EMs潜在生物标志物”的理论。该研究还发现,ASRM I/II期EMs患者体内的外泌体浓度增加,而ASRM III/IV期EMs患者体内的外泌体浓度减少,提示腹腔液外泌体有可能作为鉴别I/II和III/IV期EMs患者的生物标志物。Wyciszkiewicz等[15]的研究对比了EMs、卵巢癌及子宫内膜癌患者血清和腹腔液中外泌体携带的热休克蛋白含量,得出EMs患者血清和腹腔液中外泌体所含热休克蛋白高于正常组的结论。目前,关于EMs中外泌体蛋白质的研究较少,当发现一些基于外泌体的新型诊断和预后生物标志物时,基于外泌体蛋白组学的研究可能为EMs相关研究提供更全面的基础。

1.2 外泌体RNA与EMs

miRNA参与了EMs的发病机理,包括孕酮抵抗,凋亡抑制和迁移。miRNA在外泌体中能够稳定表达,不被体液中RNase降解。王礼贤等[16]的研究得出:与对照组相比,EMs患者在位子宫内膜间质细胞(eutopic endometrial stromal cells,EuESCs)外泌体中的miRNA存在差异表达。同时,Chen等[17]通过MicroRNA测序发现13种外泌体miRNA(miRNA-1908、-130b、-451a、-486-5p、-4488、-432、-342、-425、-505、-6508、-145、-365a和-365b)参与免疫改变和细胞增殖,并在EMs患者中差异表达。此外,Zhang等[18]的研究得出结论:EMs患者血清中的外泌体miR-22-3p和 miR-320a明显高于正常对照组,提示这两个外泌体miRNA可能具有作为诊断EMs生物学标志物的潜力,进一步研究发现腹膜巨噬细胞中的外泌体miR-22-3p通过调节SIRT1 /NF-κB途径促进异位子宫内膜间质细胞(ectopic endometrial stromal cells,EcESCs)的增殖、迁移和侵袭[19]。在动物研究方面,Wu等[20]研究结果表明,在小鼠体内,外泌体携带的miR-214通过直接影响结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达来影响EcESCs中的纤维生成途径。

目前,关于外泌体携带lncRNA在EMs中的研究较少。Wu等[21]发现外泌体lncRNA H19可充当竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA),通过增加miRNA Let-7的活性在转录后水平调控一型胰岛素样生长因子受体(type i insulin-like growth factor receptor,IGF1R)表达,从而降低子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)的增殖能力,提示外泌体携带的lncRNA可能与EMs存在相关性。Qiu等[22]研究发现,EMs病灶产生lncRNA-反义缺氧诱导因子(antisense hypoxia-inducible factor,aHIF)的外泌体可以将lncRNA-aHIF转移至受体人脐带静脉内皮细胞(human umbilical cord vein endothelial cells,HUVECs),随后调节HUVECs的生长,从而促进EMs发病过程中的血管生成。

虽然已报道了许多失调的miRNA在EMs相关发生发展中的研究,但是由于所取样本的异质性,周围组织细胞的干扰掩盖了子宫内膜细胞的分子标记等,导致这些研究的结果并不一致。Saare等[23]认为,为了减小所取样本的异质性,应更改实验设计,针对特定细胞群体(如上皮细胞、间质细胞等)进行研究,也可以选择细胞培养的方法来获取目标细胞以降低异质性。

2 外泌体在EMs中的作用

2.1 外泌体与EMs神经血管生成

EMs的发生发展与神经血管生成密切相关。Sampson的经血逆流学说[3]认为,子宫内膜组织逆行通过输卵管,沉积到腹膜腔中,在腹膜腔中建立血液供应并增殖,形成临床上的EMs病灶。血管生成在子宫内膜异位病变的建立和生长中起着不可或缺的作用,而血管需要神经支配来控制舒张或收缩,神经纤维产生信号(如血管内皮生长因子)引导血管生成,反过来,血管内皮细胞也发出信号(如神经营养素)来吸引轴突分布到血管。

2.1.1 外泌体与EMs血管生成 Harp等[10]将来自EMs患者EuESCs及EcESCs的外泌体与HUVECs共培养,得出外泌体可以通过旁分泌的方式促进体外血管生成的结论。该研究还通过MicroRNA测序发现,EMs患者EuESCs外泌体中的miR-21与对照组存在差异表达,而miR-21曾被报道与血管生成有关,从而提出EMs外泌体的致血管生成作用,一部分可能归因于miR-21的过度表达,并且从另一方面提示了外泌体可能作为细胞间通讯调节剂发挥作用,进一步证实Sampson的经血逆流学说。Qiu等[22]将HUVECs与携带高表达lncRNA aHIF外泌体的EcESCs共培养,发现与对照组相较,HUVEC的促血管生成行为显著增加,提示外泌体lncRNA aHIF可以从EcESCs转移到HUVECs,从而引发EMs异位微环境中HUVECs的促血管生成行为。此外,该研究还进一步探索了外泌体lncRNA aHIF转移至HUVECs后的下游事件-对照组的血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)水平显著低于实验组,表明EcESCs来源的外泌体lncRNA aHIF通过影响HUVECs中VEGF-A、VEGF-D和b-FGF的表达来发挥对HUVECs的调节作用。

2.1.2 外泌体与EMs神经生成 Sun等[24]研究发现,EMs患者EuESCs分泌的外泌体可以被背根神经节吸收,促进神经的生长,从而促进EMs的血管生成。由此可见,外泌体可作为信号传导的“中介”,通过其携带的“货物”引导神经生成,促进异位病灶的生存与生长,从而在EMs的发生发展中发挥重要作用。目前,关于外泌体与EMs神经血管生成相关的研究报道较少,有待进一步深入。

2.2 外泌体与EMs免疫失衡及慢性炎症

Sampson的经血逆流学说[3]认为,经血通过子宫收缩经输卵管逆流至腹膜腔,一旦进入腹膜,这种子宫内膜组织可以粘附在腹膜结构上,形成血液供应并发展成子宫内膜异位病变。然而,约90%的育龄期妇女存在经血逆流,而EMs发病率仅约为10%[25],这提示患有EMs的妇女可能对逆流的子宫内膜碎片存在功能失调的免疫反应,阻止了它们被免疫系统清除,并最终促进成了异位病变处的炎症、血管生成和病理环境[26]。近来的研究发现,EMs的发生发展与免疫机制的失衡和慢性炎症密切相关,而外泌体与免疫系统的失衡及慢性炎症存在一定的关联。Wyciszkiewicz等[15]发现,与正常对照组相比,EMs患者外泌体中热休克蛋白-22水平升高,而热休克蛋白表达水平与细胞毒性免疫反应的标志物,即穿孔素和颗粒酶B表达呈正相关,提示外泌体与EMs免疫失衡之间存在一定的联系。与免疫失衡有关疾病进展的最重要因素是免疫抑制微环境的过度激活,来源于骨髓的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)已被鉴定为最强的免疫抑制细胞之一,Chen等[17]的研究认为MDSCs衍生的外泌体miRNA可能通过抑制机体的免疫功能促进EMs的发生发展,提示外泌体在EMs免疫失衡过程中发挥重要作用。外泌体可将携带的“货物”运送到盆、腹腔并将其传递至受体细胞(如:腹腔内的巨噬细胞)后,影响受体细胞的功能活动从而发挥作用。Sun等[27]通过研究得出:在小鼠EMs模型中,外泌体从ESCs转移到巨噬细胞,促使巨噬细胞转化为M2样表型并减弱其吞噬能力,从而导致免疫功能障碍,同时,ESCs来源的外泌体还可促进M2型巨噬细胞的浸润,增加小鼠异位病灶的体积和重量。

3 外泌体与EMs现有研究的局限性

虽然目前存在越来越多的研究致力于阐明外泌体与EMs发生发展之间的关系,但是现有研究仍存在以下局限性。

3.1 现存研究所取样本数量小、特异性差

在多个研究结果中均提到,关于外泌体及其携带的RNA的研究所采用的样本量小,得到的研究结果需要进行大样本量数据的检测。Nazri等[14]的研究是具有开创性,但是其所纳入的样本量少,代表性有限,故可在该研究的基础上增加样本量进一步验证其所得结果。

外泌体及其携带的某些RNA、蛋白质等不只在EMs中升高。Wyciszkiewicz等[15]研究结果显示来自卵巢癌、子宫内膜癌和EMs的外泌体中均存在小的热休克蛋白水平升高的情况,提示在选择研究目标时,应注意其是否在EMs患者中特异,如选择研究外泌体内的热休克蛋白作为生物标志物时,可增加患有其他妇科疾病患者的试验组,同时比较不同分组内研究目标的差异,从而确保结果的特异性。

3.2 EMs外泌体研究的准确性

外泌体易在体液中检测及其携带并保护其内分子不被降解的特性使其具有作为生物学标志物的潜能。值得注意的是,Vanhie等[28]提出了应提高对所得EMs生物标志物准确性的重视。应该考虑到:即使寻找到了有诊断意义的标志物,若未能核实其准确性,并转化为临床上真正有用的检测物,那么所做的研究与付出的努力将会付诸东流。加强对所研究外泌体标志物准确性的判断,并寻找将其应用于临床的方法,对EMs外泌体相关的研究至关重要。

3.2.1 排除内膜所处月经周期干扰 Nazri等[14]发现EMs患者的腹腔液中外泌体数量增加,尤其是在月经周期的增生期,提示在研究EMs与外泌体的关系时应考虑到不同月经周期子宫内膜的影响。在EMs时,月经周期对外泌体浓度的影响会导致实验结果的差异[27]。因此,在设计研究方案时,应考虑到月经周期对外泌体浓度、体内激素及体液中其它细胞因子或蛋白质等的影响,从而排除干扰因素,提高研究结果的准确性。

3.2.2 增加ASRM分期 Zhang等[18]的研究中,与ASRM I/II期EMs患者相比,miR-22-3p在EMs III/IV期的患者中升高更明显,而miR-320a在不同阶段EMs患者中无明显差异,提示其升高的水平与EMs的分期无关。这一研究结果提示,未来的研究应考虑到EMs不同ASRM分期的样本也会对研究结果造成影响,因此,设计实验时,应注意在进行样本选择和分组方面考虑所选EMs患者的ASRM分期。

4 EMs外泌体的进一步研究方向

4.1 无创EMs外泌体生物学标志物的开发

Nazri等[14]研究提出了可将腹腔液外泌体作为EMs的生物学标志物,然而,在确定了腹腔液外泌体可以作为EMs患者的诊断标志物后,如何将其应用于临床?例如,通过何种非侵入的方式获得腹腔液外泌体及设定怎样的外泌体界限值以诊断EMs。针对这一问题,Zhang等[18]的研究提出在血清中检测外泌体miR-22-3p和 miR-320a。Qiu等[22]研究发现,外泌体lncRNA-aHIF在EMs患者血清中的水平高于正常女性,提示血清外泌体RNA有作为EMs生物学标志物的潜能。从无创性的角度来看,后者的研究结果更值得深入探索。然而,Ahn等[29]指出,来自血液、尿液的外泌体可能被其中存在的影响因子干扰而使检测结果产生差异,并提出通过子宫内膜活检这一方式来检测EMs的生物学标志物。值得注意的是,EMs主要发生在育龄期女性,而子宫内膜活检有可能损伤子宫内膜基底细胞,进而影响受孕,权衡该取材方式的利弊将作为进一步研究过程中的重要步骤。此外,Harp等[10]的理论提示月经血中可能存在外泌体,外泌体伴随月经血逆流入腹腔而对EMs的发生发展过程产生影响,月经血中外泌体是否有望成为EMs新的无创诊断标志物?Qiu等[22]研究发现EMs患者血清中外泌体lncRNA aHIF较正常组升高,并与异位子宫内膜组织中lncRNA aHIF的表达水平显著相关,然而,血清外泌体lncRNA aHIF与临床病理特征之间的相关性以及循环外泌体lncRNA aHIF在EMs中的诊断价值需要在多中心大规模临床研究中进一步探索。未来的研究需要在检测手段可行性的基础上,排除不同样本来源外泌体周围的因子影响,同时,可增加循环外泌体与组织外泌体的相关性研究,以期将循环外泌体作为EMs的无创生物学标志物。

4.2 EMs外泌体RNA下游事件的阐明

有研究证实miRNA通过信号通路如PI3K/Akt和STAT3途径参与EMs的发病机制[18]。另外,王礼贤等[16]研究提示miRNA靶基因主要集中在Wnt信号通路和MAPK 信号通路上,这两个信号通路均与EMs的发生发展有着密切的联系。外泌体对EMs作用的研究已深入到miRNA水平,但对其参与EMs相关信号通路方面的研究还较少,在继续研究miRNA的同时,可深入研究其发挥作用的信号通路,有助于更好地了解外泌体发挥作用的信号途径,进一步提高对外泌体作用的认识。

5 结语

外泌体在EMs的发生发展过程中起到一定的作用,其发挥作用主要涉及细胞水平、分子生物学水平、信号通路途径和基因水平。外泌体携带的蛋白质和RNA是其发挥生物学作用的主要因素,深入探索外泌体内携带“货物”所起的作用将有助于阐明外泌体的作用机制。然而,虽然越来越多的研究涉及外泌体内容物对EMs发生发展过程的影响,但是不同研究的结果间缺乏一致性。取样时选择特定的细胞类型和外泌体分离方法有助于减少异质性,得出准确的结论。此外,由于缺乏大样本数据,部分研究结论缺乏可信性。在动物实验中获得的结论也应重新设计取样,探索该结论在EMs患病女性中是否同样成立。因此,未来的研究应注意几点:① 取样时选择特定的细胞类型如EuESCs或EcESCs;② 样本的数量可较前适当增加;③ 取样时考虑患者所处的月经周期;④ 研究的目标可进一步深入到分子生物或基因水平。以期为EMs的进一步研究和临床应用提供新的思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。