刘开辉, 刘 月, 陈 妮, 丁小维, 张智维, 刘婉婷

(陕西科技大学 食品科学与工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

芽孢杆菌(Bacillus)属于厚壁菌门,芽孢杆菌科,芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌[1].这类微生物广泛存在于土壤、植物体内、动物肠道、空气以及水体等环境中,具有抗逆性强,营养要求简单,繁殖速度快且稳定性强等特性[2,3],多数菌株具有固氮、解磷、解钾等生物活性[4],有利于提高作物产量,一些被开发为微生物菌剂已广泛应用于农业生产、食品发酵、生命健康及环境修复等方面[5-7],并发挥重要作用.

植物根际芽孢杆菌在促进植物生长、预防植物病害和增强宿主抗逆性方面具有重要作用[8].这类细菌能在植物根际长期定殖,释放多种植物激素、抗菌酶、抗菌肽以及其它活性物质调控植物生长和保护宿主免受病原菌的侵害[9-11].例如,Goswami等[12]从耐盐植物Suaedafruticosa的根际分离的地衣芽孢杆菌B.licheniformisA2能促进花生耐渗透胁迫.Hou等[13]发现玉米根际芽孢杆菌B.atrophaeusWZYH01能促进玉米生长,该菌株有利于宿主吸收K+.李虹梅等[14]报道了贝莱斯芽孢杆菌B.velezensisMC2-1基因组序列,发现该菌株基因组编码可分解植物病原真菌细胞壁组分的功能酶以及多个参与抗菌物质合成的基因簇.以前的研究表明,挖掘植物根际芽孢杆菌对开发新型生物菌肥、生防菌剂具有重要意义.

本研究从陕西省花马盐湖区盐蒿根际中分离出一株植物耐盐促生芽孢杆菌A-1,经鉴定该菌株属于芽孢杆菌B.swezeyi.通过拮抗试验发现A-1菌株对油菜黑胫病(Leptosphaeriabiglobosa)具有良好的抑制效果.全基因组测序及功能分析发现,该菌株具合成多种抗菌活性物质的基因簇,具有编码水解病原真菌细胞壁的功能酶基因和合成IAA的相关基因.本研究为芽孢杆菌B.swezeyi的开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株和供试植物:菌株A-1分离自盐蒿根际土壤,该菌株已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号:CGMCC25411).油菜黑胫病由陕西科技大学食品科学与工程学院微生物实验室保藏.供试油菜种子购买于陕西杨凌种子产业园.

培养基:PDA培养基(g/L):马铃薯200.0,葡萄糖20.0,琼脂18.0;LB培养基(g/L):蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0;TGY培养基(g/L):胰蛋白胨5.0,酵母提取物2.5,葡萄糖1.0,琼脂15.0.

1.2 实验方法

1.2.1 菌株A-1细胞的扫描电子显微镜观察

菌株A-1在LB液体培养基中30 ℃、160 r/min培养至OD600为0.8,8 000 r/min离心5 min 收集菌体,用2.5%戊二醛固定液固定2 h,用50%～100%乙醇梯度溶液对固定的细胞进行洗涤脱水,再用乙酸异戊酯置换2次,经10 000 r/min离心5 min后,菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥,最后取少许干燥细胞于硅片碳导电胶上,离子溅射金后,利用扫描电子显微镜(Applied Biosystems公司)对细胞形态进行观察.

1.2.2 菌株A-1的16S rRNA基因扩增及序列分析

提取细菌基因组DNA,使用细菌鉴定16S rRNA基因序列的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对其扩增.PCR扩增体系:2×Taq Master Mix 10 μL,27F/1492R引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O补至20 μL.PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,55 ℃退火30 s,72 ℃扩增1.5 min,30个循环;72 ℃延伸10 min.PCR产物经纯化后送至生物公司进行双向测序,所得序列在NCBI中进行比对,下载同源序列,利用MEGA 4.0软件Neighbor-Joining法构建系统发育树.

1.2.3 菌株A-1对油菜的促生研究

挑取菌株A-1单菌落接种至LB液体培养基中,于30 ℃、160 rpm摇床中培养24 h,离心收集菌体,加无菌水稀释成1×108CFU/mL的菌悬液备用.挑选饱满均匀的油菜种子,用10% NaClO溶液对种子浸泡消毒15 min,用无菌水洗涤5～6次.20 mL(120 mM/L)盐溶液同100 g营养土混匀,置于聚乙烯瓶中灭菌.试验组消毒种子接种A-1菌悬液(对照组未接菌剂),混匀后种植于上述灭菌土中,放于恒温光照培养箱中培养(18 ℃～20 ℃、光暗周期16 h/8 h、光照强度18 000 Lux).各组试验分别进行6次生物学重复.培养21天测定植株株高、根长及鲜重生物量.

1.2.4 抗菌活性研究

以油菜黑胫病为供试菌株,在PDA上进行平板生测并计算菌丝的抑制率.病原菌重复6次拮抗试验,设不接种A-1的空白对照,于培养箱中28 ℃培养7 d.

1.2.5 基因组DNA测序分析

挑取A-1菌株单菌落,提取高质量基因组DNA,利用Nanodrop、Qubit 4.0荧光计和0.35%琼脂糖凝胶电泳检测后,委托商业公司通过Nanopore和Illumina Nova Seq 6000平台对菌株A-1进行全基因组测序.使用Unicycler软件[15]对有效数据进行组装,采用Glimmer3[16]分析编码基因,通过软件(tRNAscan-SE、rRNAmmer及cmsearch)预测tRNA、rRNA及sRNA[17-19].利用RepeatMasker预测基因重复序列[20].在NR、Swiss-prot、KEGG、GO等数据库中完成基因功能注释.利用antiSMASH分析菌株的次级代谢产物合成基因簇[21].

2 结果与讨论

2.1 菌株A-1的分类鉴定

菌株A-1在TGY固体培养基上,菌落呈乳白色,表面干燥、不光滑、褶皱、隆起,如图1(a)所示;在扫描电镜下观察到菌株A-1的形态为黏连杆状,上下两端呈圆弧状,平均大小为(0.3～0.5)～(0.6～1.5)μm,如图1(b)所示.该菌株VP试验、接触酶试验阳性,甲基红试验、柠檬酸盐试验为阴性,该菌株产生IAA,能利用淀粉、葡萄糖、山梨醇及甘露糖,但不能利用乳糖.对菌株A-1的16S rRNA基因序列进行同源性比对,其16S rRNA基因同NCBI数据库中芽孢杆菌(Bacillus)多个种的相似性在99%～100%之间.NJ系统发育分析显示(图1(c)),该菌株与已报道的Bacillusswezeyi(NR_157608)亲缘性高达99%,在进化树中聚于同一个分支,步长值为100%.结合形态学、生理生化特征及系统发育关系,菌株A-1被鉴定为芽孢杆菌B.swezeyi.

2.2 菌株A-1对油菜的耐盐促生作用

在盐胁迫下,菌株A-1对油菜生长的影响如图2所示.接种菌株A-1的油菜长势旺盛、叶片肥厚、根系发达(图2(a)).与对照组相比,A-1菌液灌根处理的油菜植株根长、株高和鲜重分别增加了42.35%、27.24%和105.61%(图2(b)和图2(c)),由此可见,菌株A-1提高了油菜对盐碱胁迫的抗性,并促进其生长.

图2 菌株A-1对油菜幼苗的耐盐促生作用

2.3 抗菌活性研究

抗菌活性研究发现(图3),油菜黑胫病在PDA上菌落呈灰白色,菌丝粗壮、菌丝体发达(图3(a)和图3(b));拮抗试验(图3(c)和图3(d))发现,芽孢杆菌A-1显著抑制油菜黑胫病菌丝的生长(抑制率为88.06%),其菌丝多处出现不规则球状膨大的畸形结构,膨大部分易破裂并释放出细胞内容物.这些结果表明,菌株A-1可能产生活性物质抑制该病原菌菌丝生长,并引起细胞溶解死亡.

图3 菌株A-1对病原菌的拮抗作用

2.4 菌株A-1基因组测序及组装分析

B.swezeyiA-1全基因组测序及组装最终得到一条完整的线性基因组序列,长度为4 591 993 bp,GC含量为44.39%,测序精确度为99.962%,编码4 948个基因,编码基因平均长度811.11 bp,编码区总长度占基因组的87.40%.基因组预测到85个tRNA、24个rRNA和38个sRNA,9个散在重复序列和91个串联重复序列(表1和图4).菌株A-1和B.swezeyiCH43_1T(GCA_008180465.1)基因组同源性为97.2%.B.swezeyiA-1基因组数据提交至NCBI数据库,登录号为SRR21869158.

表1 A-1全基因组信息

图4 基因组圈图(由外至内:基因组大小,正向链上蛋白编码基因,反向链上蛋白编码基因,正向链上tRNA(黑色)和rRNA(红色)基因,反向链上tRNA(黑色)和rRNA(红色)基因,GC含量,GC-skew值)

2.5 基因组的功能注释

B.swezeyiA-1基因组序列分别在NCBI的NR、KEGG、Swissprot及COG数据库中分别注释了4 365、4 330、3 758和3 594个编码基因.比对到B.swezeyiCH43_1T菌株基因数最多(3 892个).GO功能注释发现,分子功能(molecular function)共注释1 842个基因,生物过程(biological process)注释1 638个基因,细胞组分(cellular component)注释593个基因.KEGG富集分析发现,共4 330个编码基因富集到209条代谢通路中,主要包括双组分调节系统(two-component system)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、ABC转运蛋白(ABC transporters)、碳代谢(carbon metabolism)和细菌群体感应(quorum sensing)等.

2.6 拮抗物质分析

在B.swezeyiA-1基因组中发现14个次级代谢产物合成相关基因簇,其中7个基因簇参与合成多烯类(bacillaene)、丁酰苷菌素(butirosin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、丰原素(fengycin)和儿茶酚型嗜铁素(bacillibactin)等多种抗菌化合物(表2).Cluster 1与BGC0001089来源的多烯类合成基因簇相似性为100%;Cluster 9与BGC0000310来源的杆菌肽合成基因簇相似性为100%;Cluster14与BGC0000527来源的mersacidin合成基因簇相似性为100%;Cluster 6与BGC0000195来源的丰原素合成基因簇相似性为93%.儿茶酚型嗜铁素可以竞争性夺取真菌生长所需的铁离子[22].丰原素(属于环脂肽)能穿透细胞膜并形成离子孔道,导致细胞死亡,对植物病原真菌具有强烈的抑制活性[23].菌株A-1基因组中存在7种功能未知的基因簇(Cluster2、4、7、8、10、11和13),这些可能参与其他新抑菌物质的生物合成.此外,B.swezeyiA-1基因组还中存在多个编码几丁质水解酶、几丁质脱乙酰酶及葡聚糖苷酶的功能基因(表3),这些酶能催化真菌细胞壁的水解[24],在拮抗植物真菌感染方面具有重要作用.

表2 菌株A-1次级代谢产物合成基因簇

表3 菌株A-1功能基因注释结果

续表3

菌株A-1基因组中存在生物膜合成有关的基因(abrB,sigW,sinI,sinR和spo0A)、吲哚-3-乙酸合成相关基因(yhcX,dhaS和patB)(表3).生物膜的形成是影响菌株在植物根际的长期定殖的关键因素[25],其中Spo0A是枯草芽孢杆菌生物膜发育形成的关键基因[26].yhcX,dhaS和patB参与吲哚-3-乙酸(IAA)的生物合成[27],调节植物激素水平、提高抗逆性[10].由此说明,菌株A-1通过形成生物膜和合成吲哚-3-乙酸调控其在宿主植物根际定殖并促进植株生长.

3 结论

本研究对芽孢杆菌A-1进行分类鉴定,该菌株属于B.swezeyi.菌株A-1导致蔬菜黑胫病菌丝畸形生长和细胞溶解,对植株具有耐盐促生作用.全基因组测序发现,该菌株基因组具有合成多烯类、丁酰苷菌素、抗霉枯草菌素、丰原素和儿茶酚型嗜铁素等多种抗菌活性物质的基因簇以及编码水解真菌细胞壁的几丁质水解酶、葡聚糖苷酶等.此外,该菌株能编码生物膜合成和吲哚-3-乙酸合成相关基因.本研究表明B.swezeyiA-1在生物菌肥开发以及生防领域具有重要应用前景.