何承辉，李红红，吕佳敏，邹国安，阿吉艾克拜尔·艾萨#（.中国科学院新疆理化技术研究所新疆特有药用资源利用重点实验室，乌鲁木齐 8300；.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004；3.中国科学院大学，北京 00049）

香青兰Dracocephalum moldavicaL.为唇形科一年生草本植物，是新疆道地药材，资源丰富；药用部位为地上部分，用于治疗动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛、高血压、心肌缺血等心血管疾病[1]。目前临床上使用香青兰药材的制剂有9个，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准（维吾尔药分册）》。其中益心巴迪然吉布亚颗粒为香青兰单味药组成的制剂[2—3]，国内有5个厂家生产该制剂。益心巴迪然吉布亚颗粒具有补益心脑、利尿、止喘的功效，但该制剂工艺简单，采用水煎煮后制备成颗粒剂，药材中部分脂溶性成分未被充分提取。为保证其疗效，本课题组采用醇提取和大孔树脂纯化的方法制备了香青兰有效部位（effect parts ofD.moldavica，EPDM）[4]，主要活性成分有黄酮类化合物[5—6]，如田蓟苷（tilianin，TL）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（luteolin-7-Oβ-D-glucuronide，LG）、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（diosmetin-7-O-β-D-glucuronide，DG）和芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（apigenin-7-O-glucuronide，APG）等，具有扩张冠脉、降低冠状动脉血管阻力的功能[7]；还有苯丙素类化合物，如迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）等，具有抗血栓、抗血小板聚集、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等功能[8—9]。这些EPDM 中的成分都有一定心血管药理作用，具有很好的研究价值，但其中仍有未知成分有待研究。

目前关于EPDM的研究大多集中于药理方面，如香青兰总黄酮具有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化、防哮喘等多种药理作用，可参与调节多种细胞内外信号通路[10—12]。但目前对其药效物质基础的相关研究较少，仅对EPDM的部分成分进行了评价，未见针对EPDM的化学轮廓定性分析及指纹图谱的定量研究。鉴于此，本研究采用高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（HPLC-Q-Exactive-MS）联用技术，结合数据库筛查、文献检索、对照品比对等方式，对EPDM进行化学成分的定性表征，同时建立EPDM 指纹图谱及HPLC多成分含量测定方法，为EPDM的全面质量评价和控制提供依据。

1 材料

1.1 主要仪器

Q-Exactive 型高分辨质谱仪、Ultimate 3000 型HPLC仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司； 1260型HPLC仪购自美国Agilent公司。

1.2 主要药品与试剂

10 批EPDM 均由新疆药物研究所按文献[4]方法自制，批 号 分 别 为160726、160727、160728、181016、181017、181018、2011015、2011017、220408、220409（分别编号为S1～S10），纯度不低于53.06%。LG、RA 对照品（批号分别为111968-201602、111871-202007，质量分数分别为97.7%、98.1%）购自中国食品药品检定研究院；TL、APG对照品（批号分别为E-1170-20102223、E-2352-20121721，质量分数均不低于98.0%）购自上海同田生物技术股份有限公司；DG对照品（批号90954，质量分数为98.3%）购自上海优宁维生物科技股份有限公司；乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合对照品溶液①的配制

精密称取LG、APG、DG、RA 和TL 对照品适量，用70%乙醇制备成质量浓度分别为0.592、0.503、0.485、0.595、0.192 mg/mL 的对照品储备液。精密吸取上述各成分的对照品储备液（LG 1.0 mL、APG 0.2 mL、RA 2.0 mL、DG 1.0 mL、TL 5.0 mL），置于同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得上述成分质量浓度分别为59.20、10.06、97.0、59.50、96.0 μg/mL的混合对照品溶液①。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取EPDM 约10.0 mg，置于25 mL 容量瓶中，加入25 mL 甲醇，称定其质量；在功率250 W、频率40 kHz 条件下超声30 min，待冷却至室温，再次称定其质量；损失的质量用甲醇补足，摇匀，使用0.45 μm 滤膜过滤，收集续滤液，即得。

2.2 HPLC-Q-Exactive-MS 联用技术对EPDM 成分进行鉴定

2.2.1 色谱条件

采用Shim-pack-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm），以乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～23 min，10%A；23～59 min，12%A→26%A；59～70 min，28%A；70～110 min，27%A）；检测波长为330 nm；柱温为35 ℃；体积流量为1.0 mL/min；进样体积为50 μL。

2.2.2 质谱条件

使用Q-Exactive 型高分辨质谱仪，离子源为可加热电喷雾离子源，在正、负离子模式下检测。鞘气压力为35 psi，辅助气压力为10 arb，喷雾电压为2.8（—）、3.3（+） kV，离子传输管温度为320 ℃，辅助气温度为310 ℃，碰撞能量为20、40、60 eV；检测方式为Full MS/dd-MS2，分辨率分别为70 000（+）、17 500（—），扫描范围为质荷比（m/z）100→1 500。采用Thermo Xcalibur 软件采集数据。

2.2.3 化学成分数据库的建立与数据分析

通过关键词“dracocephalum” “chemical component”在CNKI、ChEMBL 和PubChem 等数据库中进行文献检索，将香青兰属植物中已报道的化合物收录于自建的内部数据库中。采用HPLC-Q-Exactive-MS 联用技术在正、负离子模式下对EPDM 进行全扫描，收集数据。根据化合物的保留时间、精确m/z、特征碎片离子、相关文献报道以及建立的香青兰属植物内部数据库，推测其可能的结构。

2.2.4 化合物鉴定结果

正、负离子模式下EPDM 的总离子流图见图1。结果显示，共鉴定出11个化合物，其具体信息见表1。

表1 EPDM中化合物鉴定结果

2.3 EPDM的HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度考察

取“2.1.2”项下EPDM供试品溶液（样品编号S1），按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，以8 号峰为参照峰（该色谱峰分离度较好，且有较大的峰面积），计算得各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.04%、相对峰面积的RSD均小于0.48%（n＝6），表明该方法精密度良好。

2.3.2 重复性考察

按“2.1.2”项下方法配制6 份EPDM 供试品溶液（样品编号S1），按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.15%、相对峰面积的RSD均小于4.67%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性考察

按“2.1.2”项下方法制备EPDM供试品溶液（样品编号S1），于制备后0、2、4、8、12、24 h，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰为参照峰，计算得各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.23%、相对峰面积的RSD均小于3.17%（n＝6），表明供试品溶液在制备后24 h 内稳定性良好。

2.3.4 HPLC指纹图谱的建立

取10批EPDM样品，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，再分别按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，收集色谱图。将10批供试品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A 版）》，以样品S1 的图谱为参照图谱，设置时间窗宽度为0.1 min，采用自动匹配方法经多点校正后生成指纹图谱，并以中位数法生成对照图谱R，详见图2。结果，10 批样品共标定出了10 个共有峰。

图2 10批EPDM的HPLC指纹图谱和对照图谱R

2.3.5 共有峰的指认

将对照图谱R与混合对照品的图谱（取“2.1.1”项下混合对照品溶液①按“2.2.1”项下色谱条件进样测定后所得）进行对比，共指认出5 个共有色谱峰，其中1 号峰为LG、3 号峰为APG、4 号峰为RA、5 号峰为DG、8 号峰为TL。结果见图3。

图3 对照图谱R和混合对照品溶液①的HPLC图

2.3.6 相似度评价

以对照图谱R 为参照，通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》对10批EPDM样品进行相似度评价。结果显示，样品S1～S10的指纹图谱与对照图谱R 的相似度分别为0.996、0.996、0.995、0.962、0.994、0.977、0.963、0.998、0.986、0.985，均大于0.96，表明10 批EPDM样品之间的差异较小，其质量稳定性和均一性良好。结果见表2。

表2 10批EPDM的相似度评价结果

2.4 HPLC法测定EPDM中5种指标成分的含量

2.4.1 混合对照品溶液②的配制

分别精密称取LG、APG、DG对照品适量，用75%甲醇配制成质量浓度分别为149.6、233.0、139.2 μg/mL 的对照品储备液；精密称取RA对照品适量，用甲醇配制成218.4 μg/mL 的对照品储备液；精密称取TL 对照品适量，用70%乙醇配制成197.5 μg/mL 的对照品储备液。精密吸取不同体积的各对照品储备溶液（LG 1.0 mL、APG 1.0 mL、RA 1.0 mL、DG 1.0 mL、TL 2.0 mL）置于同一10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合对照品溶液②。

2.4.2 线性关系考察

精密吸取“2.4.1”项下混合对照品溶液②0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。将各混合对照品溶液连续进样，以进样质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得到的回归方程及线性范围见表3。结果显示，在进样质量浓度范围内，所有标准曲线均表现出良好的线性（R2≥0.999）。

表3 EPDM中5种指标成分的标准曲线和线性范围

2.4.3 精密度考察

取“2.4.1”项下混合对照品溶液②，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。结果显示，LG、APG、RA、DG、TL 峰面积的RSD 分别为1.20%、3.18%、0.74%、1.14%、1.17%（n＝6），提示仪器精密度较好。

2.4.4 稳定性考察

取“2.1.2”项下EPDM供试品溶液（样品编号S1），分别于制备后0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。结果显示，LG、APG、RA、DG、TL含量的RSD 分别为1.06%、2.31%、0.35%、0.97%、1.08%（n＝6），提示供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性考察

按照“2.1.2”项下方法配制6 份EPDM 供试品溶液（样品编号S1），按照“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，按照外标法计算样品中5种成分含量。结果显示，LG、APG、RA、DG、TL含量的RSD分别为1.74%、1.92%、0.58%、1.32%、0.95%（n＝6），提示该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率考察

精密称取已知5种指标成分含量（LG 26.585 3 mg/g、APG 7.401 7 mg/g、RA 43.914 6 mg/g、DG 20.938 9 mg/g、TL 83.675 5 mg/g）的EPDM 粉末6 份，置于25 mL 容量瓶中；精密加入近似等含量的5种对照品储备溶液，制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算加样回收率。结果显示，LG、APG、RA、DG、TL 的平均加样回收率分别为97.75%、98.37%、95.12%、95.19%、96.59%，RSD 分别 为1.56%、2.93%、2.57%、2.55%、0.86%（n＝6），提示该方法的准确度良好。

2.4.7 含量测定

按“2.1.2”项下方法制备不同批次（S1～S10）EPDM的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样检测，按照外标法计算5种指标成分的含量。各批次样品重复进样测定3 次，计算平均值。结果显示，各成分含量分别为21.268 3～29.243 9 mg/g（LG）、6.365 4～7.771 7 mg/g（APG）、37.327 4～45.671 2 mg/g（RA）、17.169 9～21.985 9 mg/g（DG）、66.940 4～91.206 3 mg/g（TL）。结果见表4。

表4 10批EPDM中5种指标成分含量测定结果（mg/g，n＝3）

3 讨论

本研究比较了不同提取溶剂（50%、70%、100%甲醇）、不同超声提取时间（30、40、50 min）对EPDM 中成分提取效率的影响。结果显示，甲醇提取液总离子流图的色谱峰较多、基线噪声较小，另外超声时间不同对提取结果并无明显影响。因此，本研究使用甲醇为提取溶剂、超声提取30 min作为最佳的样品提取方法。

本研究采用HPLC 法测定了EPDM 中LG、APG、RA、DG、TL 的含量，分别考察了乙腈-0.4%磷酸溶液（27∶73，V/V）等度洗脱、乙腈-0.4%磷酸溶液（20∶80，V/V）等度洗脱、乙腈-0.5%甲酸溶液（10∶90→27∶73）梯度洗脱等流动相体系。结果显示，使用乙腈-0.5%甲酸溶液作为流动相时，梯度洗脱效果最好，出峰情况良好，色谱峰的分离度较高。因此，本研究选择乙腈-0.5%甲酸溶液作为流动相。

本研究采用HPLC 法，建立了EPDM 的HPLC 指纹图谱，共标定10个共有峰。相似度评价结果表明，10批EPDM 供试品的HPLC 指纹图谱相似度高，均在0.96 以上，表明各样品的相似情况良好，且各共有峰保留时间稳定，符合中药指纹图谱的技术要求。并且，本研究建立了5 个指标成分的HPLC 定量分析方法，方法学考察符合相关要求。这也说明本研究所建立的成分鉴定、指纹图谱和定量分析方法稳定可行、结果可靠，适用于EPDM的综合质量评价和控制。