赵丹华，杨立宏，刘欣玉，黄艳秋，吴小红，李玉华

·技术与方法·

不同实验条件对新型冠状病毒疫苗临床血清IgG抗体检测结果的影响

赵丹华，杨立宏，刘欣玉，黄艳秋，吴小红，李玉华

102629 北京，中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室

2019 年底，突如其来的新型冠状病毒疫情暴发，各国迅速从不同技术路线展开针对新型冠状病毒的疫苗研发，以期早日战胜病毒带来的威胁，恢复正常的生活秩序。目前已上市或正在研发的新型冠状病毒疫苗包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等，其中核酸疫苗是国际疫苗研发的新技术[1]。中国第一个进入临床试验的新型冠状病毒疫苗是军事医学科学院研发的重组腺病毒载体 COVID-19 疫苗（Ad5-nCoV）[2]。在免疫 28 d 后，对有症状新冠感染的有效性为 57.5%，对重症新冠感染的有效性为91.7%[3]。北京生物制品研究所、北京科兴中维生物技术有限公司和武汉生物制品研究所的新冠灭活疫苗先后在我国获得附条件审批上市，免疫 2 针后，疫苗接种者均产生高滴度抗体，保护效力分别为 79.34%、> 50% 和 72.51%[4-5]。2020 年辉瑞公司的 BNT162b2 和莫德纳公司的 mRNA-1273 mRNA 疫苗获批使用，两款疫苗均显示出超过 90% 的有效性，将 mRNA 疫苗的研究推向新高度[6]。2023 年 3 月石药集团新型冠状病毒 mRNA 疫苗（SYS6006）在中国纳入紧急使用，我国也迎来首款国产新型冠状病毒 mRNA 疫苗。安徽智飞龙科马生物制药公司的亚单位蛋白疫苗可调控机体合成高水平的中和抗体，是全球首个获批临床使用的新冠病毒重组亚单位蛋白疫苗[7]。

对新型冠状病毒疫苗临床血清的评价主要包括 IgG 结合抗体、假病毒中和抗体和真病毒中和抗体，其中 IgG 结合抗体检测没有相应的标准品及标准方法，均为企业自研方法，用来评价疫苗免疫后抗体阳转率和抗体滴度水平。本研究筛选了几种可能影响 ELISA 检测结果的关键实验参数及实验条件，考察不同条件对新冠病毒疫苗临床血清的 IgG 结合抗体滴度检测结果是否会造成影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 6 份新型冠状病毒 mRNA 疫苗（针对 RBD区域）临床人血清，1 份健康人血清作为阴性对照。

1.1.2 试剂 Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-His Recombinant Protein (HPLC-verified) 和Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein 购自北京义翘神州科技股份有限公司；羊抗人 IgG HRP 购自美国 Southern Biotech 公司；PBS 和终止液购自北京索莱宝科技有限公司；Tween-20 和BSA购自美国 Sigma 公司；TMB 显色液购自美国 Surmodics 公司。

1.1.3 仪器 Infinite M200 Pro 酶标仪购自瑞士 Tecan 公司；S16-2 生化培养箱购自美国 Shel Lab 公司。

1.2 方法

1.2.1 IgG 抗体检测方法 新型冠状病毒疫苗临床人血清 IgG 抗体检测采用 ELISA 方法：将抗原用 PBS 稀释至目标浓度，每孔加入 100 μl，4 ℃条件下包被过夜；用 PBST（1 × PBS + 0.05% Tween 20）洗涤 5 次，300 μl/孔；用含 2% BSA 的 PBST 37 ℃封闭 1 h，300 μl/孔；PBST 洗涤5 次；用 PBST 将样品从 1:100 开始，按 3 倍梯度进行稀释，稀释至 1:72900，100 μl/孔加于酶标板上，并置于37 ℃孵育；PBST 洗涤 5 次后加入 100 μl 用 PBST 稀释的羊抗人 IgG HRP，37 ℃孵育 1 h；PBST 洗涤 5 次后加入 100 μl TMB 显色液，37 ℃避光显色 10 min；每孔加 50 μl 终止液后，450 nm/630 nm 波长测定值。以每板阴性血清对照孔均值的 2.1 倍作为抗体滴度计算 cut-off 值。

1.2.2 不同抗原 采用 Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein 和Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-His Recombinant Protein (HPLC-verified) 2 种不同抗原包被后进行 IgG 抗体检测。包被浓度均为 1 μg/ml，样品孵育时间均为 0.5 h。进行 2 次实验。

1.2.3 不同抗原包被浓度 采用 1 μg/ml 和 2 μg/ml 浓度对抗原进行包被，抗原分别为 Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein 和 Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1-His Recombinant Protein (HPLC-verified)，样品孵育时间选择 0.5 h，进行 IgG 抗体检测。各进行2 次实验。

1.2.4 不同样品孵育时间 采用 1 μg/ml Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein 包被，样品孵育时间分别为 0.5、1、2 h，进行 IgG 抗体检测。

1.2.5 不同计算方法 将 1 μg/ml Recombinant SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD-His Recombinant Protein 包被，样品孵育时间为 0.5 h，进行 2 次 IgG 抗体检测。计算方法 1：采用 GraphPad Prism 软件进行结果计算：选取“XY”模式下的输入 2 个重复值的模式，将稀释度置于“X”列，将对应值置于后续的“Y”列，将 cut-off 值置于第 8 行；选择“Analyze”下“Transform”，将 X 列的值进行 log10 的转换后，选择“Nonlinear [x regression (curve fit)”项下“log[agonist] vs. response-Viable solpe (four parameters)”，勾取“Interpolate”项，得到计算值后，选取 interpolated X mean values 的 DATA，选择“Analyze”下“Transform”，将 X 列的值进行 10[x] 的转换，即得到待测样品的抗体值。计算方法 2：抗体滴度 = 大于 cut-off 值的最大稀释度× 最大稀释度值 ÷ cut-off 值。

1.3 统计学处理

采用 GraphPad prism 8.0 软件计算结果并分析数据，进行配对检验和随机区组方差分析，> 0.05 时差异无统计学意义。

2 结果

2.1 不同抗原

将浓度为 1 μg/ml 的不同抗原 IgG 抗体滴度 2 次实验结果（表1）取均值后进行配对检验，= 1.423，= 0.228，差异无统计学意义。

2.2 不同抗原包被浓度

将不同浓度 RBD 抗原 IgG 抗体滴度 2 次实验结果（表1）取均值后进行配对检验，= 1.068，= 0.346，差异无统计学意义。将不同浓度 S1 抗原 IgG 抗体滴度2 次实验结果（表1）取均值后进行配对检验，= 0.920，= 0.426，差异无统计学意义。

2.3 不同样品孵育时间

将不同样品孵育时间 RBD 抗原 IgG 抗体滴度进行随机区组方差分析，= 0.199，= 0.822，差异无统计学意义，见表2。

2.4 不同计算方法

将不同计算方法 RBD 抗原 IgG 抗体滴度 2 次实验结果取均值后进行配对检验，= 1.387，= 0.260，差异无统计学意义，见表3。

表1 不同浓度 RBD 抗原和 S1 抗原 IgG 抗体滴度

3 讨论

评估受试者血清中抗新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）抗体水平的变化规律对疫苗免疫效果评价极其重要[8-9]。SARS-CoV-2 是具有包膜的正链 RNA 病毒，Spike 蛋白（S 蛋白）是其重要的受体结合位点，具有与细胞表面特异性受体结合、介导病毒外膜与细胞融合、病毒吸附和穿膜等作用[10]。抗体通过识别 S 蛋白、阻断其与细胞表面特异性受体结合，增强机体应对病毒感染能力，从而发挥抗病毒作用[11]。有研究表明，血管紧张素转化酶 2（angiotensin-converting enzyme，ACE2）是 SARS-CoV-2 侵入宿主细胞的特异性受体[12]，新冠病毒 S 蛋白上的受体结合区（receptor binding domain，RBD）与 ACE2 受体结合后可诱导病毒进入宿主细胞[13]。受试者机体产生的抗 SARS-CoV-2 抗体可有效对抗和阻止 SARS-CoV-2 继续侵入人体细胞[14]。监测抗体水平，研究抗体的产生时间、变化规律等，可以观察免疫保护的持久性[15]，用于疫苗长期免疫效果评价。

本研究对新型冠状病毒疫苗（针对 RBD 区域）临床血清 IgG 抗体检测的几个不同实验条件进行了分析探讨。S 蛋白是新型冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有S1 和S2 两个亚基。其中S1 主要包含 RBD，负责识别细胞的受体。S2 包含融合肽，介导病毒与宿主细胞融合。本研究分别将S1 蛋白和 RBD 蛋白作为抗原对血清进行 RBD-IgG 抗体检测，这两种抗原都含有 RBD，从统计学上分析结果无差异，而 S1 中其他成分对该实验干扰较小。对于该实验来说，抗原浓度 1 μg/ml 和 2 μg/ml 均足够检测 72900 IgG抗体，样品孵育时间为 0.5 h 时，72900 IgG 抗体已能够充分与抗原结合。而本研究使用的两种计算方法虽然抗体滴度绝对值上略有差异，但是在统计学上无差异。本研究探索的几个实验条件均为新型冠状病毒疫苗临床血清 IgG 抗体检测的适用条件，未涉及极限条件，且样本量也较小，后续还需扩大样本量继续进行分析。目前新型冠状病毒疫苗临床血清 IgG 抗体检测没有统一的方法，缺乏标准品来进行统一赋值，不同企业之间的临床数据无可比较性，建议建立统一科学有效的新型冠状病毒疫苗临床血清 IgG 抗体标准品和检测方法，这也是本研究下一步需要努力的方向。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.013

国家重点研发计划（2021YFC2302404）

吴小红，Email：wuxiaohong@nifdc.org.cn

2023-09-18