田亚宾，沈舒，周海卫，许四宏

·技术与方法·

第二代人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品的研制

田亚宾，沈舒，周海卫，许四宏

100050 北京，中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一个小的环状双链-DNA 病毒，属于乳头瘤病毒家族。主要感染皮肤、生殖器和上呼吸道的表皮细胞。目前，大约 200 多种 HPV 型别被鉴定发现[1]。HPV 的基因组长约为 8000 bp，主要分为三个区：早期基因、晚期基因和长调控区。早期基因编码 6 个早期蛋白，包括 E1、E2、E4、E5、E6 和 E7，主要负责病毒的转录和复制。其中，E6 和 E7基因编码与细胞癌变转化相关的蛋白。晚期基因 L1 和 L2 主要负责编码衣壳蛋白[2]。根据其与癌症的相关性，分为高危型 HPV（HR-HPV）和低危型 HPV（LR-HPV）。目前，将 14 种 HPV 型别（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）定为 HR-HPV，4 种 HPV 型别（26、53、73、82）列为潜在 HR-HPV。HR-HPV的持续性感染是造成宫颈癌及多种生殖道癌症的主要病原体。在中国，69.1% 的宫颈癌病例为 HPV16 和 HPV18 感染，14.7% 为 HPV31、33、52、58 和 59。HPV39、45 和 56 占宫颈癌的 4.5%，剩余的病例是比较少见的其他型别，如 HPV66[3]。

由于 HPV 在体外无法分离培养，血清学方法检测 HPV 的灵敏度较低。在临床上，主要通过检测核酸诊断 HPV 感染。国内外已有众多商品化 HPV 核酸检测试剂，这些试剂采用的方法学繁多，包括 PCR 荧光法、PCR 反向杂交法、基因芯片法、恒温扩增法、杂交捕获法、测序法等[4-5]。大多数试剂基于高度保守的 L1 区，还有少数试剂集中于 E1、E2、E6、E7 区。目前，国内已研制成功人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品，由于 HPV DNA 的量值为参考范围（106～ 107copy/ml）且未覆盖 HPV51、HPV53 和 HPV56 高危型别样本，故在实际应用中存在一定的局限。本研究旨在更新和完善人乳头瘤病毒全基因组分型国家参考品，更好地适用于该类试剂的质量控制和评价。

1 材料与方法

1.1 材料

23 种不同型别的 HPV 全基因组质粒由亚能生物技术（深圳）有限公司提供；5 株 HPV 阴性的病原体分别为巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）、沙眼衣原体（CT）、B 族链球菌（GBS）和解脲脲原体（UU），来源于本实验室；人乳头瘤病毒 16 型 DNA 国际标准品购自英国国家生物制品检定所（NIBSC，编号：06/202），为冻干样品，5´106IU/支或 5´106Geq/支。将样品平衡至室温，加入 500 μl 无 DNase/RNase 去离子水溶解，得到终浓度为 107IU/ml 的 HPV16 DNA 国际标准品。

1.2 方法

1.2.1 病毒株的鉴定和复核 所有样品使用亚能生物技术（深圳）有限公司、湖南圣湘科技有限公司、江苏硕世生物科技有限公司、艾康生物技术（杭州）有限公司、凯普生物科技有限公司的 HPV 核酸（分型）检测试剂进行复核检测，验证不同样品是否存在交叉污染。严格按照各企业的产品说明书进行操作和结果判定。

1.2.2 样品的分装 使用 Qubit ds DNA HS 分析试剂盒对高浓度的样品进行初步的定量，然后将各 HPV 样品使用含 2 ng/μl 的人基因组 TE 溶液稀释分装，每支 100 μl。5 种 HPV 阴性的不同病原体用 2 ng/μl 的人基因组 TE 溶液稀释分装至 500 μl/支。

1.2.3 不同型别 HPV DNA 的溯源赋值 通过设计针对质粒通用区段基因的引物和探针，采用荧光 PCR 法检测，并使用双平行线法分析数据，将候选样品溯源至 HPV16 DNA 国际标准品赋值[6]。具体步骤如下：将 WHO HPV16 DNA 标准品分别稀释至 8´104、4´105、2´106IU/ml，将不同型别 HPV 参考品同步系列稀释 5、25、125 倍。采用 QuantiTect® Probe PCR 试剂检测，每个样本设置 3 个复孔，检测后获得标准曲线和测试曲线，采用 Stats模型进行双平行线分析拟合。在 3 个不同的实验室分别进行 5 次标定。检验分析两条直线的斜率在统计学上有无差异，是否平行。若平行，计算出各测试样本的检测值。通过 5 次独立的检测，计算每个样品的均值，确定为最终的浓度值。

1.2.4 协作标定研究 经验证分装后，将参考盘分发不同的实验室进行协作标定研究。各实验室按照各自企业生产的 HPV 核酸（分型）检测试剂说明书和（或）协作标定方案检测复溶后的样本。各实验室将检测结果汇总，依据各试剂盒的检测范围评价符合率和检测限。其中检测限性能指标参照行业标准，评估单个反应中检出的最小样品量（即 IU/反应）。

1.2.5 稳定性研究 将参考盘中的 14 种 HR-HPV 样本按照以下条件处理：于室温（20 ～ 27 ℃）放置 1 d 和反复冻融 5 次。然后系列稀释 10、100 倍，使用商品化的人乳头瘤病毒核酸检测试剂（荧光 PCR 法）、HPV 分型（25）检测试剂（PCR-反向点杂交法）检测原倍、10 倍、100 倍稀释后样本，使用高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒（杂交捕获二代法）（即 HC2）和 Care HPV 核酸检测试剂检测原倍样本，结果与存放于–20 ℃条件下的参考品比较，以考核参考品的加速稳定性和冻融稳定性。

2 结果

2.1 参考品的组成

本参考品含 23 种不同型别的 HPV 全基因组 DNA，所有样品经测序确认后，采用商品化 HPV 核酸检测试剂（荧光 PCR 法）进行复核测定。结果符合预期型别，且不同样本间无交叉污染，表明可作为新一代国家参考品的候选样本。为了评价试剂的特异性，本研究选取了 5 种经性传播的 HPV 阴性病原体，分别为 CMV、HSV-1、CT、GBS 和 UU。将上述 5 个 HPV 阴性样本和 23 种不同型别 HPV 质粒组成新一代国家参考品。

2.2 不同型别 HPV DNA 的溯源赋值

对 23 种不同型别的 HPV DNA 进行溯源赋值。以 HPV16 型别为例，HPV16 型国际参考品和 HPV16 国家参考品系列稀释后检测，获得国际标准品曲线和测试曲线。结果显示（图1），两条曲线的线性符合要求，且两条曲线平行（> 0.01，= 1.08），双平行线法赋值得到该型别 HPV DNA 含量为 1889748.693 IU/ml。平行 5 次实验测定 HPV DNA 含量分别为 3472702.503、2956621.885、1842298.508、4737508.297、1889748.693 IU/ml，计算均值后乘以稀释倍数 5，即HPV16 DNA 终浓度为 1.49´107IU/ml。按照以上分析计算，所有 23 种不同型别的 HPV 参考品溯源赋值结果（表1）显示，HPV DNA 的含量在6.59 ～ 7.17 Log10IU/ml。5 次检测结果的标准差（SD）均不高于 0.27 Log10，变异系数（CV）≤ 4.1%。

2.3 协作标定结果

汇总来自不同实验室的 37 种 HPV 核酸检测试剂的结果，大多数试剂能够准确地检出各试剂检测范围内的相应型别，与预期的结果一致。极少数试剂在检测中存在漏检 HPV52 型或假阳性结果，可能与分析灵敏度低或实验室污染有关。对于各试剂的检测范围外的型别，高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒（杂交捕获二代法）在检测 HPV43、HPV66、HPV82 出现交叉反应，其余试剂的检测结果均为阴性，不存在交叉反应。在检测 5 份 HPV 阴性病原体，与预期结果一致，均为阴性。此外，通过系列稀释不同型别 HPV 分析了不同检测试剂的最低检测限。由于不同试剂覆盖的检测范围内的型别不同，故本研究集中分析汇总不同试剂检测 14 种 HR-HPV 的最低检测限。结果发现不同试剂的最低检测限存在较大差异。各试剂的检测限范围为1 ～ 1.9 × 105IU/反应。大多数基于 PCR-荧光法或 PCR-杂交法的试剂的检测低于 104IU/反应，3 种基于杂交捕获法的 HPV 核酸试剂的检测限在 104IU/反应上下波动。结果表明这些试剂由于不同的引物体系、样本处理及灵敏度的差异，造成最低检测限的差异也较大。

图1 HPV16 型国家参考品与 HPV16 国际参考品的标定

表1 23 种不同 HPV 型别全基因组质粒的量值结果

注：HPV 参考品量值使用 IU/ml 表示，等同于 Geq/ml 和 copy/ml。

2.4 稳定性研究

14 种不同型别 HR-HPV 参考品放置于不同条件后，HPV 核酸分型检测试剂（PCR-反向点杂交法）的检测结果显示，原倍、10 倍和 100 倍稀释的样品在 3 种条件下均符合预期结果，且显色均匀较一致。HPV 核酸分型检测试剂（荧光 PCR 法）的结果显示，不同的稀释梯度 HPV样品在 3 种条件下，结果一致且 Ct 值相近（△Ct ≤ 1，图2）。上述结果显示基于荧光 PCR 和 PCR 反向杂交法试剂检测均表明该参考品比较稳定。然而，基于杂交捕获法的试剂检测结果显示，各个型别在不同的条件下，存在一定的差异，且没有一定的规律性（图3）。这种差异可能与杂交捕获法是基于信号放大的原理有关。

图2 HPV 核酸检测试剂（荧光 PCR 法）评价国家参考品的稳定性

图3 HPV核酸检测试剂（杂交捕获法）评价国家参考品的稳定性

2.5 质量标准的确定

结合协作标定和稳定性研究的结果，参考上一代国家参考品的质量标准，确定了新一代国家参考品质量标准。第二代国家参考品主要适用于荧光 PCR 法、PCR-杂交法、测序法等靶向扩增法试剂的质量评价，检测结果应满足：①准确性：检测试剂盒检测范围内人乳头瘤病毒不同型别国家分型参考品，结果应均为相应型别阳性；②特异性：检测 5 份 HPV 阴性参考品，结果应均为阴性且检测不同型别的 HPV 参考品，要求高危型别 HPV 应不得出现交叉反应，低危型别 HPV 交叉反应率应不高于 10.0%；③精密度：检测试剂盒检测范围内 HPV 型别参考品，重复检测10 次，要求检测结果均为相应型别阳性，且Ct 值的变异系数不大于 5.0%；④最低检测限：应不高于104IU/反应。

3 讨论

HPV 核酸检测对于宫颈癌筛查具有重要的临床意义，通过检测 HPV 的感染状态筛出宫颈癌前病变和宫颈癌的风险人群并及时进行治疗，能够有效预防或降低宫颈癌的患病风险。此外，HPV 核酸检测对于 HPV 流行病学调查和 HPV 疫苗的效力评价具有重要的意义。目前，市场上有大量商品化核酸检测试剂，大多数试剂能够检测 14 种高危型别，还有一部分试剂主要用于多种高、低危型别的分型检测[3]。为了提高和规范这类试剂的质量，本研究在延续上一代国家参考品的基础上，研制了新一代 HPV 全基因组分型国家参考品。由于 HPV 不同于其他病原体，无法获得病毒培养物。尽管临床样本容易收集，但无法满足大量试剂的评价使用，且在量值的确定上也存在一定困难。新一代参考品延续上一代参考品，合成模拟的全基因组质粒样本用于评价试剂，这与 WHO 国际标准品的性质一致[7]。不同于上一代参考品覆盖的型别，本参考品覆盖了所有的高危型和潜在高危型型别样本，能够更好地评价目前市场上不同 HPV 核酸检测试剂的性能，如准确性、特异性和检出限等。

为了保证不同检测试剂的溯源和结果的可比，本研究对每种样品进行了一一标定。传统上，质粒样品可通过分子量换算确定拷贝数，然而，对于不同仪器不同批次间存在一定的差异。最近，WHO 在原有 HPV16 和 HPV18 DNA 国际标准品的基础上，增加了 HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV6 和 HPV11 等 7 种型别国际标准品，覆盖的型别依然有限。本研究参考了 WHO 协作标定的方法，以保证不同代次间的差异[6]。针对质粒通用区段设计引物和探针，采用荧光 PCR 方法将 23 种不同样品溯源至 WHO HPV16 DNA 国际标准品。对于上述样品的赋值，提高了不同试剂间分析灵敏度可比性。

此外，本套参考品发放至不同实验室进行了适应性验证。对于不同方法学的检测试剂进行了验证，比如高通量测序、杂交捕获法、酶切信号放大法等。结果发现基于杂交捕获法在检测HPV43、HPV66 和 HPV82 存在一定的交叉反应，与之前的报道一致[8-9]。对于样品的稳定性采用基于杂交捕获法的试剂进行了评价，结果发现检测结果不稳定，这可能是由于杂交捕获类的检测类试剂是基于信号放大的原理，其分析灵敏度较 PCR 方法低[10]。样品接近试剂的检测限，重复性较差，故不适用于该类试剂的性能评价。

总之，本研究建立了第二代 HPV 全基因组分型国家参考品，并制订了相应的质量标准。此参考品主要适用于基于 PCR-荧光探针法、PCR-反向杂交法、基因芯片法、恒温扩增法、测序法等靶向扩增方法学原理的 HPV核酸（分型）检测试剂的质量评价。该参考盘的建立有助于评价该类试剂，以保证在不同实验室和不同试剂盒检测获得有意义且可比的结果。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.011

许四宏，Email：xushong@nifdc.org.cn

2023-05-12