吴晓云,李思龙,刁飞燕,李启艳,冉金凤,刘春霖

(山东省食品药品检验研究院,国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室,山东 济南 250101)

植物原料及其提取物由于安全性高、作用温和等独特的优势,因此在化妆品行业有良好的开发和应用前景。甘草提取物主要包括黄酮类、三萜类和多糖类等活性成分,具有美白、防晒、抗氧化、抗炎和抗菌等功效[1-4],被广泛应用于护肤类、美白类、防晒类等多种化妆品中。目前,涉及化妆品中甘草类化学成分的检测标准有3个,国家标准《GB/T 35954-2018 化妆品中10种美白祛斑剂的测定高效液相色谱法》、行业标准《SN/T 1500-2004化妆品中甘草酸二钾的检测方法液相色谱法》与团体标准《T/CAFFCI 1-2018 化妆品用原料甘草酸二钾》,且以上标准只涉及甘草酸二钾的检测。甘草提取物中除含甘草酸二钾,还含有甘草苷、异甘草苷、甘草查尔酮B、甘草素、异甘草素、甘草查尔酮A和光甘草定等多种化学活性成分,本文建立多波长高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法可同时测定以上8种甘草化学成分。

文献报道甘草成分检测方法有高效液相色谱法[5-6]、超高效液相色谱法[7]、液相色谱-质谱法等[8-10],主要涉及中药材及其提取物研究。化妆品领域甘草化学成分的测定方法主要为高效液相色谱法[11-12],文献[13]在237 nm波长下测定化妆品中的4种甘草成分,陆军等[14]在237 nm波长下测定7种甘草成分。笔者未见文献报道化妆品中甘草查尔酮B和异甘草素的测定,单一检测波长很难兼顾每个组分的最佳检测灵敏度,且同一提取方法可能不适用于多种复杂的化妆品基质。本方法在优化乳液类、膏霜类、水剂类和凝胶类4种基质前处理方法基础上,建立多波长HPLC-DAD法同时测定8种甘草化学成分,该方法操作简单、灵敏度和准确度高,为产品质量提供保障。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备LC-40D高效液相色谱仪(日本岛津公司),配DAD检测器;Mettler Toledo MS电子天平(梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司);Universal 320R高速离心机(德国Hettich公司);KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Milli-Q型超纯水仪(美国密理博公司)。

1.2 材料与试剂乙腈、甲醇(色谱纯,霍尼韦尔贸易上海有限公司);磷酸(优级纯,国药集团化学试剂有限公司);超纯水。

标准品:甘草苷(批号:Z10J8X39611,含量98%,上海源叶生物科技有限公司);异甘草苷(批号:Y15A10H95344,含量98%,上海源叶生物科技有限公司);甘草查尔酮B(批号:W10S10Z96953,含量98%,上海源叶生物科技有限公司);甘草素(批号:T4890010,含量99.0%,上海安谱实验科技股份有限公司);甘草酸二钾(批号:F12M6Z1,含量98%,上海源叶生物科技有限公司);异甘草素(批号:38640010,含量99.9%,上海安谱实验科技股份有限公司);甘草查尔酮A(批号:P21O8F46473,含量98%,上海源叶生物科技有限公司);光甘草定(批号:K27A9R59960,含量98%,上海源叶生物科技有限公司)。30批美白类化妆品均为市售产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;进样体积:10 μL。流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脱(0～4 min,24%A;4～27 min,24%A →80%A;27～30 min,80%A →24%A;30～33 min,24%A)。检测波长:231 nm(甘草苷、甘草素和光甘草定)、249 nm(甘草酸二钾)、365 nm(异甘草苷、甘草查尔酮B、异甘草素、甘草查尔酮A)。

2.2 标准溶液的制备分别精密称取甘草苷12.01 mg、异甘草苷10.65 mg、甘草查尔酮B 7.85 mg、甘草素9.50 mg、甘草酸二钾12.04 mg、异甘草素10.19 mg、甘草查尔酮A 10.29 mg、光甘草定10.83 mg,置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,配成标准储备液。分别精密吸取上述标准储备液各1.0 mL,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释并定容至刻度作为混合标准溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 乳液类和膏霜类准确称取0.5 g样品(精确至0.000 1 g)于25 mL具塞比色管中,加入0.5 mL饱和氯化钠水溶液,震荡混匀,再加入10 mL 70%甲醇,涡旋混匀5 min后,超声提取20 min,4 000 r·min-1离心4 min后,取上清液于比色管中,残渣再加10 mL 70%甲醇重复上述步骤,合并两次提取液,用氮气吹干至5 mL左右,再加入甲醇溶解定容至10 mL,-18 ℃冷冻1 h后,4 ℃下6 000 r·min-1离心10 min,取上清液经0.45 μm滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.3.2 水剂类和凝胶类准确称取0.5 g样品(精确至0.000 1 g)于10 mL具塞比色管中,加入适量70%甲醇溶液,涡旋混匀5 min至样品完全分散,超声提取20 min,冷却后定容至10 mL,-18 ℃冷冻1 h后,4 ℃下6 000 r·min-1离心10 min,取上清液经0.45 μm滤膜过滤,取续滤液,即得。

2.4 系统适用性试验精密量取“2.2”项下混合标准溶液1.0 mL置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,将上述溶液按“2.1”项下色谱条件进样。结果,在231 nm波长下8种成分分离度均大于2.5,达到基线分离,理论板数均大于7 000。

2.5 线性关系考察精密量取混合标准溶液适量,用甲醇分级稀释,按照上述色谱条件分别进样,以溶液浓度(X)为横坐标,色谱峰面积(Y)为纵坐标,进行线性回归。结果表明,8种成分在一定浓度范围内线性关系良好,结果见表1。

表1 各成分的线性范围、回归方程和相关系数

2.6 回收率试验取4种不同化妆品空白基质(水剂类、膏霜类、凝胶类和乳液类)各0.5 g,分别精密加入标准储备液适量,使添加水平分别为低、中和高3个水平,每个水平平行制备3份样品,按“2.3”项下制备供试品溶液后进样测定,得到8种成分平均加样回收率范围为88.3%～96.2%,RSD为0.9%～3.5%,回收率良好,结果见表2。

表2 8种成分的平均回收率和RSD(n=3)

2.7 稳定性试验取回收率试验制备的低浓度供试品溶液(水剂类、膏霜类、凝胶类和乳液类),按上述色谱条件分别在0、2、4、6、12、24 h进样分析,分别记录8种成分峰面积,计算RSD在1.1%～2.0%之间(n=2),表明8种成分在24 h内稳定性良好。

2.8 精密度试验取系统适用性试验所制备的混合标准溶液,重复进样6次,分别记录8种待测物峰面积,计算RSD在0.7%～1.4%之间,表明仪器精密度良好,结果见表3。

表3 8种成分精密度考察

2.9 检出限与定量限逐级稀释标准溶液,把信噪比(S/N)为 3∶1时的浓度作为最低检出浓度,信噪比(S/N)为10∶1时的浓度作为最低定量浓度,按称取0.5 g样品定容至10 mL进行计算,得到样品检出限和定量限,结果见表4。

表4 8种成分检出限与定量限

2.10 样品测定对30批美白类化妆品进行测定,4批样品含甘草酸二钾,含量在6.75～312 mg·kg-1之间;5批样品含光甘草定,含量在1.93～23.9 mg·kg-1之间;其余6种成分未检出。典型样品色谱图见图1。混合标准品溶液色谱图见图1。

1.甘草苷;2.异甘草苷;3.甘草查尔酮B;4.甘草素;5.甘草酸二钾;6.异甘草素;7.甘草查尔酮A;8.光甘草定

3 讨论

3.1 检测波长的选择8种成分最大吸收波长有差异,用单一检测波长,很难兼顾每个成分的最佳检测灵敏度,故利用DAD检测器的优点,设置多个波长进行检测,使各成分均在最佳灵敏度下被检测。试验对8种化合物在190～400 nm全波长范围扫描,在不考虑有较大干扰的末端吸收下,根据各成分的紫外吸收谱图来确定检测波长。结果表明:甘草苷在231 nm波长处有最大吸收、甘草素和光甘草定在231 nm波长附近有较强吸收,故选择231 nm为检测波长;甘草酸二钾在249 nm波长处有最大吸收,故选择249 nm为检测波长;其余4种成分,异甘草苷在361 nm波长处有最大吸收,甘草查尔酮B在340～370 nm有最大吸收,异甘草素和甘草查尔酮A在360～380 nm有最大吸收,综合考虑灵敏度及化妆品中防腐剂等基质的干扰,其余4种成分选择365 nm为检测波长。不同波长下8种成分的标准色谱图见图1。

3.2 流动相的选择试验考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相时8种成分在相同色谱条件下的分离效果。结果显示,采用乙腈-0.1%磷酸溶液流动相进行分析时,基线平稳,分离度和峰形均较好,故选择该流动相系统。考察不同梯度洗脱程序,结果显示在最终确定的色谱条件下,8种成分在较短的洗脱时间内分离度良好。

3.3 色谱柱的选择对比Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Kromasil 100-5-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)3种不同品牌色谱柱的分离效果。结果表明,使用Phenomenex C18柱,待测组分分离度均较好,分离时间较短且峰形良好,故选择该色谱柱进行分析。

3.4 前处理方法的研究

3.4.1 提取溶剂的选择本研究考察了甲醇浓度分别为90%、70%、50%、30%时,对4种不同基质样品的提取效果。结果发现90%与70%甲醇的提取效率较高,由于70%甲醇提取的供试品溶液中干扰物质较少,且待测组分的峰形较好,故选用70%甲醇溶液作为提取溶剂。

乳液和膏霜类基质中,比较加入与不加入0.5 mL饱和氯化钠水溶液,再进行超声提取,结果显示加入后提取效率显著提高。由于先加入饱和氯化钠水溶液,震荡混匀使样品变成流动状态,样品能够完全分散利于待测成分的释放,加速进入提取溶剂中。水剂和凝胶类基质加入饱和氯化钠水溶液后的提取效率,与不加无显著差异。

3.4.2 提取方式与时间的选择以70%甲醇溶液作为提取溶剂,分别比较超声提取(5、10、20、30 min)和震荡提取(0.5、1、2、3 h)对同一样品的提取效率。试验结果表明,超声提取优于振荡提取;超声提取20 min 时,各目标成分提取量最高,主要因为超声提取利用超声波产生的强烈震动及扩散效应,增加了溶剂穿透力,加速目标物扩散和溶解。最终试验选用超声提取20 min。

3.4.3 供试品溶液纯化方式的选择供试品溶液提取、浓缩与定容之后,再用0.45 μm滤膜过滤后进样,样品图谱中干扰峰较多,背景噪声干扰较大,且有些供试品溶液在静置2 h后会析出絮状沉淀。考虑到化妆品成分的复杂性,本研究采用低温样品纯化,选择将供试品溶液-18 ℃冷冻1 h,在低温4 ℃下6 000 r·min-1离心10 min后过滤进样,可以有效降低基质类成分的干扰。

3.5 结论本研究建立了多波长HPLC-DAD法同时测定化妆品中8种甘草化学成分的方法,方法学验证结果表明该方法准确可靠、灵敏度高,适用于化妆品中8种甘草化学成分的分析及定量检测,为化妆品原料和产品的监管提供技术支持。