赵佳慧,葛修通,任文静,周悦,张凡,2

(1.辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600;2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心,辽宁 大连 116600)

黄柏是芸香科植物黄皮树(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥树皮,味苦,性寒,归肾、膀胱经。黄柏具有清热燥湿、泻火解毒、除骨蒸的功效[1],临床多用于湿热泻痢、湿热黄疸[2]。黄柏经过盐炙后增强滋阴降火、退虚火的作用[2]。肾阴是一身阴气之本,是肾中物质基础的体现部分,有滋润、濡养全身脏腑的作用。肾阴虚大多由于久病等因素,导致肾中阴液亏虚,虚火内生所导致的病症。

肠道菌群及其代谢物在维持肠道微生态环境中发挥重要作用,并与多种疾病的发生密切相关。本文采用16S rRNA高通量测序方法,分析黄柏盐炙前后对肾阴虚大鼠肠道菌群多样性的影响,并筛选丰度具有显著差异的菌群。并从肠道菌群角度探讨黄柏盐炙后滋肾阴效果的增强以解析黄柏盐炙的炮制原理。

1 材料

1.1 动物成年健康雄性SD大鼠70只,体重(200±20)g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司提供,合格证号为 SCXK(辽)2020-0001。本研究的所有程序均按照辽宁中医药大学附属医院动物伦理委员会(许可证号:2019YS[DW]-029-01)批准的方案进行。

1.2 试药黄柏[购自四川雅安,经鉴定为芸香科植物黄皮树(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥树皮];食盐(大连盐化集团有限公司);六味地黄丸(兰州太宝制药有限公司);纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);氢化可的松注射液(2210191,天津金耀药业有限公司);大鼠cAMP、cGMP酶联免疫分析试剂盒均购自上海科兴有限公司(产品批号:22102445N、22102450N);测序仪(Illumina,美国,型号:Illumina Miseq);生物安全柜(HR1500-ⅡA2)。

2 实验方法

2.1 黄柏及盐黄柏制备

2.1.1 生黄柏制备取黄柏原药材,除去杂质,喷淋清水,润透,切丝,干燥,得生黄柏。

2.1.2 黄柏盐炙品制备取净黄柏丝,用盐水拌匀(每100 kg黄柏丝,用食盐2 kg),闷润2 h,待盐水被吸尽后,置炒制容器内,用文火加热至160 ℃时炒6 min,取出晾凉,得黄柏盐炙品。

2.2 供试品的制备分别称取适量黄柏生品、黄柏盐炙品饮片,加10倍量水浸泡30 min,煎煮60 min,过滤药液,在药渣中再加入8倍量水煎煮40 min,过滤,合并两次滤液,浓缩至适宜浓度,黄柏生品和黄柏盐炙品低、高剂量组给药浓度分别为0.11、0.96 g·mL-1[1],取六味地黄丸作为阳性药适量研磨成细粉,加入适量水溶液,溶解至浓度为0.02 g·mL-1[1]。给药组大鼠的给药量为1 mL/100 g。

2.3 动物分组及给药造模将70只SD级雄性大鼠随机分为7组,即空白对照组、模型对照组、阳性对照组、黄柏生品低剂量组、黄柏生品高剂量组、黄柏盐炙品低剂量组、黄柏盐炙品高剂量组,每组10只大鼠。

每天灌胃给药1次,空白对照组、模型对照组给予相同剂量的生理盐水,各组连续给药10 d。灌胃给药的第11 天开始,除空白对照组外,其他组灌胃氢化可的松造模,氢化可的松浓度为50 mg·L-1,模型组大鼠的给药量为1 mL/100 g,空白对照组给予相同剂量的生理盐水,连续灌胃4 d。

2.4 大鼠体重测定给药期间(前10 d)每3 d称量1次大鼠体重,造模期间(11～14 d)每天称量1次大鼠体重,并做好记录。

2.5 大鼠粪便样品的采集最后1次造模给药12 h后,采用提尾刺激法刺激大鼠排出粪便,将粪便放入无菌的EP管中,立即放入液氮中迅速冻存,保存在-80 ℃冰箱中。用于肠道菌群多样性的分析。

2.6 大鼠胸腺形态大鼠麻醉后迅速取出胸腺组织,用预冷的生理盐水清洗2遍,滤纸吸干水分。

2.7 大鼠肾脏指数大鼠麻醉后迅速取出肾脏组织,用预冷的生理盐水清洗2遍,滤纸吸干水分,使用万分之一天平称量各自重量,根据下面公式计算肾脏脏器指数。

脏器指数=脏器重量(g)/体重(g)

2.8 16S rRNA高通量测序技术检测大鼠肠道菌群

2.8.1 DNA提取和PCR扩增根据DNA提取试剂盒提取粪便中的总DNA,使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量,使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。对16S rRNA基因V3～V4可变区进行PCR扩增。

2.8.2 Illumina Miseq测序将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行回收产物纯化,2%琼脂糖凝胶电泳检测,并用QuantusTMFluorometer对回收产物进行检测定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库,首先进行链接接头;再使用磁珠进行筛选;利用PCR扩增的方法进行文库模板的富集;最后使用磁珠回收PCR产物得到文库。利用Illumina公司的61 Miseq PE300平台进行测序。

2.8.3 数据处理使用Fastp软件对原始测序序列进行质控,使用FLASH软件进行拼接:过滤reads尾部质量值20以下的碱基;根据PE reads之间的overlap关系,将成对reads拼接(merge)成一条序列,并筛选不符合序列,调整序列方向。使用UPARSE软件,根据相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释,比对Silva 16S rRNA数据库。

3 实验结果

3.1 肾阴虚模型大鼠建立结果与空白组相比,模型组cAMP含量明显增加(P<0.01);与模型组相比,各给药组cAMP含量明显降低,盐黄柏高剂量组cAMP含量最低,其次阳性组(P<0.01)。与空白组相比,模型组cGMP含量明显降低(P<0.01);与模型组相比,各给药组cGMP含量均增加,其中生黄柏高剂量组含量显著性升高(P<0.01)。与空白组相比,模型组cAMP/cGMP比值明显升高(P<0.05);与模型组相比,各给药组cAMP/cGMP比值均降低,盐黄柏高、低剂量组cAMP/cGMP比值明显降低(P<0.01),结果见图1。

图1 各组大鼠血清中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值图

3.2 大鼠体重变化结果空白组大鼠14 d内体重平稳增长,其余各组前10 d体重平稳增长,造模给予氢化可的松的第1天(即第11 天)开始体重明显降低,模型组大鼠体重降低趋势最为显著,盐黄柏高剂量组大鼠体重降低趋势最小,结果见图2。

图2 各组大鼠体重变化趋势图

3.3 大鼠胸腺形态结果空白组大鼠胸腺形态完整,组织肥厚,颜色偏淡;模型组大鼠胸腺萎缩不成形,布满红点,颜色偏红;其余各给药组大鼠胸腺形态均有明显改变,其中盐黄柏高剂量组大鼠胸腺形态优于其他给药组大鼠胸腺形态。

3.4 肾脏指数结果与空白组相比,模型组大鼠肾脏指数显著性增加(P<0.01);与模型组相比,各给药组肾脏指数均降低,阳性组大鼠肾脏指数显著性降低(P<0.01),盐黄柏高剂量组大鼠肾脏指数明显降低(P<0.05),生黄柏高、低剂量组大鼠肾脏指数也有所降低但无统计学差异,结果见图3。

图3 各组大鼠肾脏脏器指数图

3.5 肠道菌群多样性结果

3.5.1 组间物种OTU分析通过分析样本物种组成,并绘制稀释曲线图,发现样本16000Reads左右时曲线逐渐趋于平坦,说明测序数据量合理,样本量增加只会产生少量的新物种;基于样本不同测序深度并选取Shannon-Wiener图作为多样性指数的OTU数,绘制曲线,可知样本在4000Reads左右时曲线逐渐趋于平坦,说明测序数据量足够大,能够反映样本中绝大多数微生物多样性信息(见图4)。

图4 样本物种组成分析图

OTU聚类分析为物种组成分析的一部分,以便进一步分析肠道菌群的组成。根据Veen图(见图5)能够直观地看出5组样本中物种的重叠情况及其相似性,并统计出其共有及特有的OTU数目。基于各组肠道菌群样本,空白组特有OTU 40个,模型组特有OTU 18个,阳性组特有OTU 10个,盐黄柏高剂量组特有OTU 9个,生黄柏高剂量组特有OTU 16个;五组共有OTU 317个。

图5 OTU在不同处理组分布的Veen图

3.5.2 组间物种Beat多样性分析主坐标分析(PCoA)见图6,结果发现PC1和PC2对总体方差解释的百分比分别为19.74%和15.31%。空白组与肾阴虚模型组大鼠菌群完全分开,与空白组比较,肾阴虚模型组大鼠菌群结构具有明显差异;各给药组样本距离空白组更近,盐炙品高剂量组距离空白组更近,几乎重叠,其次是阳性药组和生黄柏高剂量组,二者几乎重叠。黄柏及其盐炙品能够明显改善肾阴虚大鼠肠道菌群的结构,盐黄柏效果明显优于生黄柏。

图6 各组大鼠肠道菌群的PCoA得分分布

3.5.3 肠道菌群结构的门、科水平分析门水平下,不同组别大鼠肠道菌群的组成情况见图7,厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度最高,拟杆菌门(Bacteroidota)和放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度次之。与空白组相比,肾阴虚模型组Firmicutes相对丰度明显减少(P<0.05),Bacteroidota、Actinobacteriota相对丰度增加(P<0.05)。与模型组相比,各给药组Firmicutes均明显升高(P<0.05),盐黄柏组相对丰度均高于生黄柏组,同种饮片下低剂量组效果优于高剂量组;各给药组中Bacteroidota明显降低(P<0.05),盐黄柏组中Bacteroidota低于生黄柏组,盐黄柏低剂量组Bacteroidota相对丰度最低;各给药组中Actinobacteriota明显降低(P<0.05),盐黄柏高剂量组Actinobacteriota相对丰度最低。

BC为空白组;MC为模型组;PC为阳性对照组;LD-RP为黄柏生品低剂量组;HD-RP为黄柏生品高剂量组;LD-SP为黄柏盐炙品低剂量组;HD-SP为黄柏盐炙品高剂量组

科水平下,不同组别大鼠肠道菌群的组成情况见图8,乳酸菌科(Lactobacillaceae)相对丰度最高,其次是S24-7科(Muribaculaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)。与空白组相比,模型组Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Erysipelotrichaceae相对丰度明显降低(P<0.05),Muribaculaceae相对丰度明显增加(P<0.05)。与模型组相比,各给药组Lactobacillaceae相对丰度明显增加(P<0.05),生黄柏低剂量组丰度增加最为明显;各给药组Lachnospiraceae明显增加(P<0.05),盐黄柏低剂量组Lachnospiraceae增加最为明显;各给药组Enterococcaceae显著增加(P<0.01),盐黄柏高剂量组Enterococcaceae相对丰度远远高于其他给药组。

BC为空白组;MC为模型组;PC为阳性对照组;LD-RP为黄柏生品低剂量组;HD-RP为黄柏生品高剂量组;LD-SP为黄柏盐炙品低剂量组;HD-SP为黄柏盐炙品高剂量组

3.5.4 差异菌群筛选应用LEfSe软件根据分类学原理,对不同组别进行线性判别分析,并找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种。分析在门、纲、目、科、属分类水平上具有显著性差异的菌群,如图9。LDA判别柱形图(见图10)统计多组中有显著差异的微生物类群,通过LDA分析(线性回归分析)获得的LDA分值,该分值越大,代表物种丰度对差异效果影响越大,并以此进行分析,将各组别的优势菌群按照LDA分值由大到小的顺序进行排列,得到以下结果。

BC为空白组;MC为模型组;PC为阳性对照组;LD-RP为黄柏生品低剂量组;HD-RP为黄柏生品高剂量组;LD-SP为黄柏盐炙品低剂量组;HD-SP为黄柏盐炙品高剂量组

BC为空白组;MC为模型组;PC为阳性对照组;LD-RP为黄柏生品低剂量组;HD-RP为黄柏生品高剂量组;LD-SP为黄柏盐炙品低剂量组;HD-SP为黄柏盐炙品高剂量组

与空白组相比,肾阴虚模型组大鼠粪便中杆菌纲(c_Bacilli)、梭菌目(o_Clostridiales)、梭菌科(f_Clostridiaceae)、梭菌属(g_Clostridium_sensu_stricto_1)、异杆菌属(g_Allobaculum)等显著高于空白组。与模型组相比,生黄柏组中消化链球菌目(o_Peptostreptococcales-Tissierellales)、颤螺菌目(o_Oscillospirales)、瘤胃球菌科(f_Ruminococcaceae)、消化链球菌科(f_Peptostreptococcaceae)、罗斯氏菌属(g_Romboutsia)为优势菌群。与模型组相比,盐黄柏组中厚壁菌门(p_Firmicutes)、乳酸杆菌目(o_Lactobacillales)、肠球菌科(f_Enterococcaceae)、肠球菌属(g_Enterococcus)为优势菌群。模型组中的优势菌群在生黄柏组和盐黄柏组丰度明显降低。

4 讨论

本研究采用糖皮质激素类药物(氢化可的松)建立肾上腺皮质功能亢进型肾阴虚大鼠模型,空白组大鼠体重平稳增长,毛发柔顺,精神状态良好;肾阴虚大鼠外观表征发生改变,体重明显降低,毛发失华,扎堆拱背,精神萎靡;各给药组大鼠肾阴虚症状明显得到改善。胸腺是人体重要的免疫器官,大剂量氢化可的松损伤机体器官,抑制机体的免疫功能,模型组胸腺形态的明显改变提示其对机体免疫系统损伤尤为迅速,各给药组大鼠胸腺形态有所改善。肾阴虚模型大鼠肾脏指数明显升高,给药组大鼠肾脏指数均降低,盐黄柏组作用效果优于生黄柏组。

肠道菌群包括一系列复杂的微生物,并占有一定的比例,能够维持肠道内微生物的生态平衡,其组成变化对人体健康有一定的影响,研究证明肠道菌群与多种疾病均有密切联系。PCoA图(见图8)可以看出肾阴虚大鼠肠道菌群组成与正常大鼠明显不同。

肾阴虚由肾中阴液亏虚导致,在临床上其主要病症表现为糖尿病。中医认为糖尿病属于消渴病,由阴虚燥热引起,黄柏具有明显的降糖作用[3]。研究发现糖尿病患者Firmicutes的比例明显下降,Actinobacteriota的比例明显上升[4]。结合在门、纲、目、科、属分类水平上的差异菌群筛选的结果,与健康大鼠相比,黄柏及其盐炙品在门水平上能够上调Firmicutes比例,下调Actinobacteriota的比例,盐炙品效果更佳。Firmicutes丰度降低是肠道内微生物失调的重要特征之一[5],大多有益菌属于Firmicutes,其中o_Lactobacillales能够维持肠道内微生态环境稳定[6]。在科水平上,与模型组相比,盐黄柏组中Lactobacillaceae、Lachnospiraceae、Enterococcaceae相对丰度均有明显差异。Lactobacillaceae是肠道内的有益菌群,能够维持肠道内微生物环境稳态[7],盐黄柏通过增加Lactobacillaceae相对丰度,改善肠道菌群微生态环境。Lachnospiraceae能发酵代谢葡萄糖,产生甲酸、乙酸和丙酸等短链脂肪酸,并加快毒素的排泄[8];还能代谢色氨酸,其代谢产物能够保护肠道上皮屏障[9],盐黄柏组Lachnospiraceae相对丰度明显增加,黄柏盐炙品有缓解肠道炎症,保护肠道的潜力。Enterococcaceae的聚集物质能够促进损伤上皮细胞和内皮细胞的黏附,并促进肠内转运和糖化蛋白,体外实验中能够增强肾小管上皮细胞的黏附[10];Enterococcaceae和g_Enterococcus为盐黄柏组的优势菌群,可能与其聚集物质增强肾小管上皮细胞的黏附有关。

近年来,肠道菌群已被证实与多种疾病的发生都有密切联系,实验结果表明,肾阴虚模型大鼠肠道菌群与正常大鼠肠道菌群相比,在不同水平下物种组成及相对丰度都具有明显差异,大剂量氢化可的松改变肠道微生态,增加有害菌群定殖,减少有益菌群增殖,黄柏盐炙前后均能调节肾阴虚大鼠肠道内菌群的相对丰度,进而改善肠道微生态环境,且黄柏盐炙后调节肾阴虚大鼠肠道菌群的效果更好。