张莹,代春燕,田静,田吉来

(1.南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科,江苏 南京 210008;2.夏津县人民医院内分泌肾病科,山东 德州 253200;3.南京中医药大学医学院·整合医学学院生物化学与分子生物学系,江苏 南京 210023)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种主要累及外周关节的自身免疫性疾病,早期主要表现为关节晨僵疼痛,若疾病不能有效控制,最终导致关节畸形、关节毁损,甚至致残。尽管目前RA 治疗方面取得很大进展,但仍有部分患者未能达到临床缓解。RA 的主要病变在关节,表现为滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨破坏。滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)是关节滑膜衬里层的重要细胞成分。RA患者FLSs获得过度增殖、迁移和侵袭表型,是滑膜炎和血管翳形成的主要原因,是介导炎症和骨破坏的“罪魁祸首”[1]。目前临床上针对FLS的治疗方法有限[2-3]。

FLS主动参与RA关节局部的免疫炎症,是分泌白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的主要细胞。IL-6与其特异性受体(IL-6R)结合,进而招募糖蛋白130(gp130),三者形成有活性的IL-6/IL-6R/gp130三元六聚体复合物,激活下游通路,如信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的高度磷酸化,促进细胞增殖和侵袭[4]。针对IL-6R单抗或受体融合蛋白已成为临床治疗RA的重要药物[5]。

选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator,SERM)巴多昔芬(bazedoxifene,BAZ)被再定义为IL-6/gp130抑制剂已被广泛认可[6]:其吲哚部分和七元氮杂环拟似IL-6的Trp157和Leu57基团,可有效结合gp130的D1区域(见图1),从而发挥拮抗IL-6的作用[7-8]。本文拟采用小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,评估BAZ对CIA小鼠的治疗作用,细胞水平评估BAZ对滑膜成纤维细胞MH7A增殖、侵袭迁移的影响,探讨BAZ靶向gp130是否有可能成为治疗RA的新药。

左为BAZ的化学结构式;右为吲哚部分和七元氮杂环分别模拟IL-6的Trp157和Leu57和gp130的D1区域进行有效结合

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞DBA/1小鼠(雄性,8周)购自中国上海SLAC实验室动物有限公司[动物使用许可证号:SYXK(苏)2014-0052],并在南京鼓楼医院实验动物中心的无特定病原体(specific-pathogen-free,SPF)条件下饲养,饲养环境室温度24～27 ℃,湿度50%,水食自由,12 h交替光照。所有动物实验均在南京鼓楼医院动物研究伦理委员会批准的规程下进行(批准编号:2019AE01044)。

A.动物实验的免疫和药物干预的时间安排;B.CIA小鼠在开始免疫后不同天数下的AI评分(n=6);C.第57天小鼠后足外观的代表图;D.CIA小鼠在开始免疫后不同天数下的后肢足厚度(n=12)(Mean±SD,*P<0.05)

A.H-E和SO-FG染色结果,其中p为血管翳,e为软骨侵蚀,b为骨破坏,s为滑膜炎;B.对各组小鼠进行病理评分,其中a～d依次为骨质破坏、滑膜炎、血管翳、关节软骨的病理学评分;C.第60天小鼠后足Micro-CT的代表图(Mean±SD,t检验,*P<0.05)

A.BAZ对MH7A细胞存活的影响;B.SC144对MH7A细胞存活的影响;C.RAL和BAZ对MH7A细胞的平板克隆实验结果

MH7A细胞接种于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中,置于含5%CO2的37 ℃培养箱中培养。

1.2 药物试剂与仪器免疫用牛Ⅱ型胶原(CII,#20022)、完全弗氏佐剂(CFA,#7001)和不完全弗氏佐剂(IFA,#7002)均购于美国Chondrex公司;BAZ购于江苏正济药业股份有限公司;泊洛沙姆188(Poloxamer 188,P188)购于巴斯夫(中国)有限公司;SC144购于上海源叶生物科技有限公司;盐酸雷洛昔芬(Raloxifene,RAL)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;基质胶(#356234)购于美国Corning公司;Transwell小室(8 μm孔径,Corning,USA);酶标仪(M1000 Pro,Tecan,Switzerland);小动物活体Micro CT影像系统(Quantum GX,PerkinElmer,USA);倒置显微镜(CKX41,Olympus,Japan)。

1.3 实验方法

1.3.1 CIA小鼠模型的建立小鼠随机分为正常对照组、胶原诱导组。取2 mL浓度为2 mg·mL-1的CII醋酸溶液与等体积的浓度为4 mg·mL-1的CFA置于冰上充分混合,得到CII乳化液。在胶原诱导组的小鼠尾根部进行皮内缓慢注射所得的CII乳化液,注意避开血管,每只100 μL(含CII 100 μg)进行初次免疫,并设定为第0天。第21天,在小鼠尾根部1～2 cm处采用多点法再次注射100 μL/只同法新鲜配制的等体积CII醋酸溶液和IFA的混合乳化液进行增强免疫。自造模第21天开始,每3～4 d(每周2次)对免疫小鼠基于关节炎指数(arthritis index,AI)评分表(见表1)进行四肢关节评分,四肢关节肿胀计分相加为关节炎的总评分。评分最高分为16,评分≥4为模型成功。

表1 小鼠AI评分

1.3.2 动物分组给药将胶原诱导组的小鼠随机分为两组,即模型对照组(Vehicle组)和Bazedoxifene治疗组(BAZ组),并在初次免疫的第14天开始给药至第57天,每周6次,周日停药。动物实验的实施方案如图2A所示。给药剂量与方法如下:①正常组:生理盐水,0.1 mL·(kg·d)-1灌胃;②Vehicle组:60 mg·mL-1的P188水溶液,灌胃;③BAZ组:BAZ药物5 mg·(kg·d)-1灌胃。其中,BAZ药物的配制方法如下:取浓度为20 μg·μL-1溶解于DMSO的BAZ溶液50 μL,加入950 μL浓度为60 mg·mL-1的P188水溶液中,涡旋混匀,即得BAZ浓度为 1 mg·mL-1的药物溶液。

1.3.3 动物关节肿胀观察与病理学评价增强免疫后每3～4天,使用游标卡尺测量小鼠后肢足厚度,以此作为其关节肿胀的指标。采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,H-E)观察踝关节病理改变,番红-固绿染色(safranine o and fast green,SO-FG)观察软骨破坏,并从滑膜细胞增生、细胞浸润、关节软骨及骨质破坏进行病理学评分[9]。采用micro-CT对小鼠踝关节进行扫描成像,观察踝关节的损伤情况。

1.3.4 CCK-8法检测BAZ对MH7A细胞存活率的影响取MH7A细胞并调整细胞密度为5×104mL-1,每孔100 μL接种于96孔板,贴壁生长过夜后,将原有培养基更换为含有不同药物浓度的培养基,继续培养24 h,之后每孔加入10 μL CCK-8试剂,置于37 ℃含5%CO2培养箱孵育4 h,使用酶标仪在450 nm处检测光密度值,并计算细胞存活抑制率。实验独立重复3次。

1.3.5 平板克隆法检测BAZ对MH7A细胞增殖的影响MH7A细胞接种于6孔板中,过夜使其贴壁并使细胞融合度达到80%,第2天每孔更换为2 mL含药培养基,24 h后消化各孔细胞并用无药的完全培养基收集和重悬,然后以每皿500个细胞的密度接种于6 cm的平板培养皿中,37 ℃、5%CO2培养约15 d,弃去培养基,PBS洗涤,用冷甲醇固定0.5 h,1%结晶紫染色1 h,用水清洗后扫描所得平板培养皿。实验独立重复3次。

1.3.6 细胞划痕法检测BAZ对MH7A细胞迁移的影响MH7A细胞以每孔5×105细胞密度接种于6孔板中,并加入2 mL/孔的含血清培养基,至细胞长满后,更换无血清培养基使其饥饿过夜。采用无菌枪头进行划痕,用PBS清洗2遍后给予含不同浓度BAZ的无血清培养基,使用倒置显微镜记录划痕处细胞迁移的情况。实验独立重复3次。

1.3.7 Transwell实验检测BAZ对MH7A细胞侵袭的影响MH7A细胞接种于6孔板,当细胞融合度达60%时,加入含有不同BAZ浓度的完全培养基继续培养24 h,之后弃去培养基并用PBS洗2遍,用胰酶消化细胞,并以无血清培养基重悬使其密度为6 000 μL-1,各组细胞取200 μL加入Transwell小室的上层(含基质胶),下层则加入600 μL的含20%胎牛血清的培养基。其中上层小室基质胶需预先配制,具体方法是:基质胶和无血清培养基按体积比1∶8在冰上进行稀释,每孔40 μL加入小室的上层,37 ℃孵育4～6 h待基质胶凝固。细胞在Transwell中培养48 h后取出小室,固定,染色,在显微镜下拍照,评价细胞侵袭的能力。实验独立重复3次。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件,所有数据以Mean±SD表示,采用t检验比较两组之间的差异,P<0.05表示差异具有统计学意义。采用Graphpad Prism 7软件绘图。

2 结果

2.1 BAZ对CIA小鼠关节炎症和肿胀的影响正常组小鼠无关节发红和肿胀,Vehicle组即CIA模型组的小鼠在两次免疫后出现关节肿胀、趾端发红、足趾增厚等状况,严重者出现关节活动受限,在病情后期部分小鼠踝关节出现强直样改变。与Vehicle组相比,BAZ治疗组AI评分显著降低(见图2B,P<0.05),后足厚度也较Vehicle组明显下降,并在第32天出现显著性差异(P<0.05,见图2D)。各组小鼠后肢关节外观如图2C所示(第57天)。由于CIA模型的自限性,小鼠后肢肿胀厚度在实验后期出现轻度消退(见图2D)。

2.2 BAZ减轻CIA小鼠关节炎如图3A所示,正常小鼠踝关节未见炎性细胞浸润,滑膜增厚、骨和软骨破坏。与模型对照组相比,BAZ治疗组能缓解小鼠踝关节的滑膜炎(见图3As)、血管翳(见图3Ap)、软骨侵蚀(见图3Ae)和骨破坏(见图3Ab),其各项评分均显著性低于CIA模型组(见图3B)。以上表明BAZ可减轻小鼠关节病理损伤。Micro-CT的结果显示,与CIA模型组相比,BAZ治疗组后肢关节间隙狭窄和骨破坏明显改善(见图3C)。上述结果表明,BAZ对CIA小鼠关节炎有治疗作用。

2.3 BAZ对MH7A细胞存活和增殖的作用结果如图4A所示,随BAZ浓度的增加,MH7A的细胞存活率明显降低。SC144是gp130的抑制剂[10],该药对MH7A的细胞存活率具有浓度依赖性的抑制作用(见图4B)。BAZ和SC144对MH7A细胞的IC50值分别是12.96、11.55 μmol·L-1,说明靶向gp130可以抑制滑膜细胞存活。图3C的平板克隆实验结果进一步证实BAZ浓度依赖性抑制MH7A细胞增殖,在BAZ 20 μmol·L-1组未见明显的MH7A细胞增殖。RAL和BAZ均是ER调节剂,但RAL在抑制gp130方面较BAZ弱[7],RAL不能有效抑制MH7A的增殖(见图4C)。

2.4 BAZ对MH7A细胞划痕愈合的作用如图5所示在MH7A细胞划痕24 h后,与未接受药物的细胞组相比,BAZ给药组划痕的愈合明显受到抑制,其中15 μmol·L-1给药组最为明显,划痕依然可见。未给药组愈合修复接近100%融合,10 μmol·L-1组的划痕处部分出现了迁移的细胞。所有各组在0时的划痕一致(数据未列出)。以上说明了BAZ抑制细胞迁移的作用。

图5 划痕给药24 h后MH7A细胞愈合图(各组0时未列出)

2.5 BAZ对MH7A细胞侵袭的作用如图6所示,BAZ给药的10、20 μmol·L-1均能明显减少细胞侵袭迁移到下室的数量。说明了BAZ对MH7A细胞侵袭和迁移的抑制作用。

图6 MH7A细胞在接受BAZ作用24 h后接种于Transwell小室继续培养48 h之后细胞侵袭检测的各组代表

3 讨论

CIA模型采用异源性CII免疫动物,诱导自身免疫性反应,从而产生类似类风湿关节炎的关节红肿、滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、关节及周围软骨坏损。CIA模型是目前公认的RA最佳模型[11]。本研究以8周雄性CIA小鼠为研究对象,说明BAZ能有效降低AI评分,缓解小鼠后足肿胀,减轻RA病变,证实BAZ对RA的治疗作用。在此基础上,本研究以MH7A为模型细胞,发现BAZ具有抑制MH7A增殖、侵袭和迁移的作用,进而从BAZ干预FLS角度解释了BAZ治疗RA的具体机制。

BAZ最初是作为SERM联合结合雌激素(conjugated estrogens)以组织选择性雌激素复合物(tissue-selective estrogen complex,TSEC)的形式被美国FDA批准,用于绝经后女性骨质疏松症的治疗。在骨组织,BAZ能作为雌激素受体(estrogen receptor,ER)-β的激动剂,具有调节骨转换(bone turnover)的作用[12]。最近临床报道,BAZ能有效预防绝经后RA患者糖皮质激素诱导的骨质疏松[12]。在动物实验水平,采用去卵巢(ovariectomized,OVX)的CIA(OVX-CIA)小鼠模型可模拟女性绝经后的RA症状。基于此,因为雌二醇(17β-estradiol,E2)的抗炎作用,学者们研究发现BAZ联合E2组(TSEC)发挥对骨关节炎的治疗作用与单用E2近似,但TSEC组更能有效降低骨髓中IL-6水平、抑制破骨前体细胞(preosteoclast)形成、减少血清中的抗胶原蛋白抗体(anti-CII IgG)[13]。以同为第三代SERM的拉索昔芬(lasofoxifene,LAS)做对照,发现BAZ和LAS都能降低OVX-CIA小鼠关节炎的AI评分,抑制滑膜炎,减少软骨及骨的侵蚀[14]。BAZ和LAS在OVX-CIA模型中表现出抗关节炎和骨保护作用的双重作用,强调了SERM在应用于绝经后女性RA治疗的价值。

事实上,BAZ是多靶点药物,BAZ既充当ER配体又是IL-6/gp130的抑制剂,干预IL-6信号通路发挥抗炎作用[15]。本研究发现,gp130抑制剂SC144和BAZ均能抑制滑膜细胞存活。有报道采用抗gp130单抗能抑制RA患者破骨细胞的分化和形成[16],说明了gp130作为RA治疗靶点而充满前景。无论小鼠是否OVX,BAZ都显示了对CIA小鼠关节炎的治疗作用,但BAZ对OVX-CIA小鼠关节炎症的抑制能力弱于LAS和E2[13-14]。由于RA病理炎症是由大量分子调控的,我们建议合理采用联合用药的策略,通过抑制多个靶点分子,更好的阻止或逆转RA进展。