张荣霜,游飘雪,朱美玲,范世明*,许文,2*,黄鸣清

(1.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122;2.福建中医药大学科技创新与转化中心,福建 福州350122)

沉香为瑞香科植物白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg]含有树脂的木材,《中国药典》2020年版记载其可行气止痛,温中止呕,纳气平喘。用于胸腹胀闷疼痛,胃寒呕吐呃逆,肾虚气逆喘急[1]。现代药理学研究表明,沉香具有神经活性、胃肠调节作用、抗菌、抗炎、镇痛、镇静、治疗哮喘、抗氧化、降血糖、抗肿瘤活性[2-8]等作用。

沉香在市场上流通存有沉香片、沉香勾丝、沉香虫漏3种规格,沉香片是白木香含有树脂的片状木材。沉香勾丝是用钩刀钩剃沉香木取香时,往往要剃到白木和沉香油脂的交界处,在剃香过程中,白木屑上或多或少都附有一些沉香。这种含沉香油脂极少的沉香木屑叫“勾丝”[8]。沉香虫漏(Chong-Lou agarwood)为瑞香科植物白木香树体受到天牛、木蠹蛾或白蚁等蛀干类昆虫蛀蚀伤害形成的含有树脂的木材,具有圆形或者椭圆形的虫孔、弯曲交错的虫道(木蠹蛾、天牛幼虫等蛀食)或者大小各异、形状不规则的虫孔(白蚁等蛀食),蛀蚀面具有腐木[9]。三者使用方向不同,沉香片多用于中药饮片药用,价格高昂;沉香虫漏和沉香勾丝多用于沉香制燃“香”,但是三者打粉后外观类似,不易区分,甚至影响沉香优质优价,然而目前文献关于三者的化学对比鲜有报道。

近年来超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术已广泛应用于中药材的化学成分研究[10],并且基于质谱的定性鉴定结果利用化学计量学技术可以有效寻找不同规格间差异性成分,通过UPLC等技术定量验证可以找到有效区分定量手段,因此本研究拟基于UPLC-Q-TOF-MS鉴定并比较沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝之间的化学成分差异性,同时对3者中差异指标性成分沉香四醇和8-四氢色酮(8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羟基-5,6,7,8-四氢色酮)的含量进行测定,为沉香药材的优劣的判断提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器Xevo G2飞行时间质谱仪(美国Waters公司);ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司);ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司);CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司);KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Cascada I超纯水机(美国PALL公司);MM400研磨仪[德国莱驰(RETSCH)公司]。

A.沉香片;b.沉香虫漏;c.沉香勾丝

1.2 试药甲醇、乙腈(质谱纯,德国Merck公司);甲酸(色谱纯,阿拉丁试剂上海有限公司);沉香四醇对照品(批号:111980-201904,中国食品药品检定研究院);8-四氢色酮(批号:HR11166W2,Herbest Bio-Tech Co.,Ltd.);沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝样品由福建中医药大学黄鸣清教授收集,并经范世明正高级实验师鉴定,均为瑞香科白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Gilg],见图1;15批沉香药材(S1～S5为沉香片、S6～S10为沉香虫漏、S11～S15为沉香勾丝)用于UPLC-Q-TOF-MS分析;S16～S30为沉香片、S31～S45为沉香虫漏、S46～S60为沉香勾丝,连同S1～15,用于UPLC含量测定。样本存放于福建中医药大学药学院标本室。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 UPLC-Q-TOF-MS色谱与质谱条件Waters CORTECS UPLC C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0→0.5 min,15% A;0.5→1.0 min,15% A～25% A;1.0→6.0 min,25% A→35% A;6.0→7.5 min,35% A;7.5→9.0 min,35% A～40% A;9.0→12.5 min,40% A～58% A;12.5→13.5 min,58% A～85% A;13.5→14.0 min,85% A～95% A;14.0→16.0 min,15% A);流速0.30 mL·min-1;柱温45 ℃;进样量2 μL。飞行时间质谱采用电喷雾负离子模式,毛细管电压2.5 kV,喷雾器压力0.2 MPa,碰撞能量10～40 eV。脱溶剂气流:氮气,流速800 L·h-1,脱溶剂温度400 ℃,锥孔气流:氮气,锥孔电压30.0 V,流速50 L·h-1,离子源温度120 ℃,四极杆离子能量3.0 eV,碰撞气体:氩气。质谱测定数据采用全扫描负离子模式采集,数据采集范围m/z50～1500。

2.1.2 UPLC含量测定色谱条件色谱柱为 Waters CORTECS UPLC C18(2.1 mm×100 mm,1.6 μm);以乙腈为流动相为A,以0.1%甲酸水为流动相B,梯度洗脱(0→5.5 min,10% A～12.0% A;5.5→12.0 min,12.0% A～14.0% A;12.0→16.0 min,14% A～20% A;16.0→21.0 min,20% A～25% A;21.0→26.0 min,25% A～35% A;26.0→31.0 min,35% A～50% A),流速为0.15 mL·min-1;检测波长为252 nm;柱温为30.0 ℃;进样量为2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取沉香四醇和8-四氢色酮对照品适量,分别置于5 mL量瓶中,用甲醇溶解稀释至刻度,分别制成浓度为354 μg·mL-1沉香四醇和254 μg·mL-1的8-四氢色酮的单一对照品母液,其他不同质量浓度的混合对照品溶液由对照品母液逐级稀释,即得。

2.2.2 供试品溶液的制备取各沉香粉末(过三号筛)0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入95%乙醇10 mL,密塞,称定重量,浸泡0.5 h,超声处理1 h(功率250 W,频率40 kHz),放冷,再次称定重量,用95%乙醇补足减失的重量,用高速离心机10 000 r·min-1离心10 min,取上清液,用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液,用于UPLC含量测定。精密移取供试品溶液1 mL,置于25 mL量瓶中,用10%甲醇稀释定容至刻度,摇匀,即得,用于UPLC-Q-TOF-MS成分鉴定。

2.3 沉香的化学成分鉴定结果

2.3.1 UPLC-Q-TOF-MS成分鉴定沉香样品在“2.1.1”项下色谱条件及质谱条件进行分析,沉香的乙醇提取液的UPLC-Q-TOF-MS总离子流图(TIC)(见图2)。

化合物的鉴定方法是:首先,通过查阅国内外沉香化学成分研究相关文献,建立沉香化学成分数据库。其次,根据UPLC-Q-TOF-MS总离子流图上各个色谱峰所得到的化合物分子离子峰信息,通过Masslynx V4.2软件在±10 ppm的质量偏差范围内计算其精确分子式,与前期已建立的化学成分数据库进行比对,对各个色谱峰化合物进行初步鉴定;第三,为了进一步确认化学结构,UPLC-Q-TOF-MS采用MSE模式对各个分子离子峰进行碰撞诱导解离(collision induced dissociatin,CID),通过二级质谱的裂解,获得化合物相应的碎片离子,根据碎片离子的精确质量数信息推测质谱裂解情况。共鉴定出沉香中27个化学成分(见表3)。以峰2为例,Q-TOF-MS给出分子离子峰317.100 4,为一级质谱离子[M-H]-,Masslynx V4.2质谱软件计算出化学分子式C17H18O6,与沉香化学成分数据库比对,与文献报道的沉香四醇分子式一致。再根据Q-TOF-MS二级碎片离子有m/z299,281,253,190,175,经过裂解推测二级质谱上m/z299峰为[M-H-H2O]-,m/z281为[M-H-2H2O]-,m/z190为[M-H-2H2O-C7H7]-,m/z253为[M-H-2H2O-CO]-,m/z175峰为[M-H-2H2O-C7H7-CH3]-,可能的裂解图(见图3)。其他化合物的推测使用了相似的策略,根据UPLC-Q-TOF-MS测得的分子离子峰、二级碎片离子信息,由Masslynx V4.2软件计算出精确分子量,与对照品或文献中报道的沉香化学成分数据进行比对,共推测鉴定出27个化合物,其中化合物12、20、22、23、25、26、27因为分子离子峰信息与数据库无法匹配,但是二级裂解均具有m/z299,281碎片离子(见图3)与sesquiterpene-2-(2-phenylethyl) chromone母核化合物二级碎片离子相一致,因此推测其是sesquiterpene-2-(2-phenylethyl) chromone的衍生物[11],结果见表1。

表1 3种不同类别沉香的化学成分鉴定结果

图3 峰2(沉香四醇)可能的裂解图

2.3.2 多元统计分析基于上述鉴定结果,将所采集的质谱数据先通过Progenesis QI V 2.0软件进行峰对齐、峰提取、峰鉴别、归一化等预处理[12],将峰面积数据进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),结果见图4。将15批沉香中27种成分的峰提取结果绘制聚类热图,结果见图5。

CXP为沉香片;CXCL为沉香虫漏;CXGS为沉香勾丝

2.4 UPLC定量测定

2.4.1 专属性试验分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各2 μL,按“2.1.2”项下色谱条件进样分析。供试品溶液与混合对照品溶液在相同位置具有相同色谱峰,专属性良好,结果见图6。

A.对照品;B.沉香片;C.沉香虫漏;D.沉香勾丝 1.沉香四醇峰;2.8-四氢色酮峰

2.4.2 方法学考察

2.4.2.1 线性关系考察取“2.2.1”项下方法制备的对照品溶液,用10%甲醇稀释配制系列梯度浓度的对照品混合液。按“2.1.2”项下色谱条件测定峰面积,用对照品质量浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)进行回归,绘制标准曲线,得到回归方程和相关系数,结果见表2。

表2 线性关系考察结果

2.4.2.2 精密度取“2.2.1”项下制备的对照品溶液,按“2.1.2”项下色谱条件1 d内连续进样6次测定,测定各成分的峰面积,分别计算其峰面积的RSD,其精密度结果(见表3),表明仪器精密度良好。

表3 各化合物的精密度、重复性、稳定性试验结果(n=6)

2.4.2.3 稳定性按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液(S4批次),分别于0、2、4、6、10、12、24 h按“2.1.2”项下色谱条件进样测定,测定各成分的峰面积,求出峰面积的RSD。结果见表3,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.2.4 重复性精密称取同一批沉香样品6份(S4批次),按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.2”项下色谱条件进样测定,计算2个化合物的含量及其RSD,结果见表3,表明方法重复性良好。

2.4.2.5 回收率精密称取“2.4.2.4”项下已测知含量的沉香样品(S4批次)6份,约0.1 g,按照重复性试验测得的结果近似1∶1加入近似等量的对照品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.2”项下色谱条件进样测定待测成分的量,计算回收率,结果见表4。

表4 沉香样品中2个待测成分的回收率试验结果(n=6)

2.4.3 含量测定分别精密称取不同批次的沉香样品粉末(过3号筛)0.2 g各2份,分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.2”项下色谱条件进样测定峰面积,计算各批次沉香样品中2种化合物的含量,结果见表5。

表5 60批沉香各成分的含量(mg·g-1,n=3)

2.4.4 箱型图分析进一步用OriginPro 2021软件根据不同品类的沉香UPLC的含量测定数据结果,分析生成沉香四醇和8-四氢色酮含量的箱型图,如图7所示。

图7 沉香中沉香四醇(A)和8-四氢色酮(B)含量箱型图(***P<0.001)

3 讨论

色酮类成分是沉香的主要成分之一,且是沉香中具有特征性的一类成分。在不同规格沉香药材(沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝)中,如何快速鉴定并寻找其差异性成分是本研究的关键技术,因此本文首先基于UPLC-Q-TOF-MS技术手段,对沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝3种规格样品进行化学成分快速鉴定,由于色酮类成分结构含有多个羟基,该类化合物在负离子模式下能表现出较高的响应。最终在UPLC-Q-TOF-MS负离子模式下,从沉香3种规格中鉴定27个化合物。在此基础上,利用OPLS-DA法,即通过分析样品经Progenesis QI V 2.0软件所得数据建立的一个对沉香样品分类和预测的监督方法,OPLS-DA参数R2X描述了X变量中有多少变化可以用所选的组件解释,R2描述了模型的拟合程度,Q2表示X对Y的预测能力,R2和Q2的取值范围为0～1,其中越接近1表示越适合度和预测能力[12]。不同批次的样品经OPLS-DA分析,沉香样品根据3种规格聚成3类,拟合优度R2X(cum)=0.831,预测优度R2Y(cum)=0.979,Q2=0.945,说明沉香样本在OPLS-DA得分图上聚类良好,显著分离。R2X为0.831,表明所选组件可以对数据集中83.1%的变化进行建模,又因为R2X(cum)、R2Y(cum)和Q2参数数值接近1,表明此OPLS-DA模型的模型拟合良好且预测能力好,可用于区分3种规格的沉香。进一步通过分析OPLS-DA模型中27个变量的VIP值,由于VIP值与模型贡献率呈正相关,以VIP>1为标准筛选出引起不同批次间差异较大的化学成分,发现包括沉香四醇(2)、8-四氢色酮(6)以及化合物bi-2-(2-phenylethyl) chromone(17)、aquisinenone K(18)、6,8-dihydroxy-7-methoxy-2-(2-phenylethyl) chromone(11)、4′,4”-dime-thoxyaquisinenone K(16)、[(3-Benzyl-4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl) oxy]acetic acid(15)、sesquiterpene-2-(2-phenylethyl) chromone derivative(12,20)、6-hydroxy-2-[2-(4′-hydroxy-3′-methoxy phenyl) ethyl]chromone(7)、5,6,7,8-tetrahydroxy-2-[2-(4-methoxyphenyl)ethyl]-5,6,7,8-tetrahydrochromone(3) 、[(4-Butyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl) oxy]acetic acid(9)、6-hydroxy-2-[2-(4-hydroxyphenyl) ethyl]chromone(8)、6,8-dihydroxy-2-[2-(3′-hydroxy-4′-methoxyphenyl) ethyl]chromone(4)、6-hydroxy-2-[2-(4′-hydroxyphenyl) ethyl]chromone(13)、2-(4-Butoxybenzyl) succinic acid sesquiterpenoids(10)、qinanone D(14)共17个成分的VIP值均大于1分,提示这些化合物是造成不同批次沉香差异性的主要化学成分,并通过进一步的热图分析发现3种不同规格的沉香17个差异性成分的响应差异比较:沉香片中化合物2、3、8、11、13、14等响应最大,优于沉香虫漏和沉香勾丝,但化合物12、20的响应较小;沉香虫漏中化合物6、7、12、15、16、17、20等响应值高于沉香片和沉香勾丝,但化合物2、3、4、8、9、13的响应值均较低;沉香勾丝中大部分化合物的响应值较低,仅有化合物21和12响应值相对较高。

从TOF-MS定性鉴定并分析筛选了沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝3种规格的差异性成分,如何进一步验证其分析的可靠性,需要进一步的含量测定验证,结合中国药典中沉香指标性成分有沉香四醇(2)和8-四氢色酮(6),本文进一步利用UPLC技术对两者含量进行测定,结果结合箱型图发现沉香片中沉香四醇的含量显著高于沉香虫漏和沉香勾丝,沉香虫漏和沉香勾丝没有差别,沉香虫漏中8-四氢色酮含量显著高于沉香片和沉香勾丝,而沉香片和沉香勾丝的含量较为接近。UPLC测定含量结果与OPLS-DA和热图分析结果相一致,即从定量角度也验证了沉香3种不同规格的差异性,并且提示基于UPLC测定沉香四醇和8-四氢色酮含量也可以作为不同规格沉香分类的参考依据之一。通过利用UPLC-Q-TOF-MS的快速鉴定以及化学计量学的差异分析,可以快速筛选中药不同规格中的差异性成分,进一步的根据TOF-MS鉴定结果筛选合适的指标进行UPLC的定量验证并构建定量方法,可为从中药复杂体系中发现其规格区分的差异性Q-marker提供技术参考。

综上,本试验建立了不同规格沉香药材(沉香片、沉香虫漏、沉香勾丝)UPLC-Q-TOF-MS鉴定化学成分的分析方法,并建立其化学计量学分析方法;UPLC-DAD法可同时测定沉香中沉香四醇和8-四氢色酮的含量,可作为区分不同品种沉香的质量标志物,为沉香的质量控制提供新的依据。