罗 强 兰碧洋 黄斯阳 张晓安 武国煜

广西壮族自治区民族医院胸心腺体科,广西南宁市 530001

肺癌是最为常见的癌症死亡原因,2018年全球预计有210万例新肺癌病例和180万例死亡病例,分别占癌症发病数和死亡数的11.6%和18.4%[1]。尽管已经确定了许多与肺癌相关的生物标志物,但是肺癌的发生发展过程十分复杂,难以凭借单一指标来预测。拷贝数变异(Copy number variation,CNV)指基因组DNA的改变,其特征在于正常(二倍体)基因组中DNA序列数的改变。这些DNA改变可能会影响单个基因、染色体区域或整个染色体。研究表明,CNVs与肺癌及其他几种恶性疾病有关[1]。通常,在癌症中,DNA拷贝数的减少或增加可能对影响肿瘤发生和发展产生影响。

众多研究表明KEAP1-NFE2L2通路的激活与肺癌的耐药及预后相关[2-8]。KEAP1-NFE2L2通路涉及主要的基因包括KEAP1、NFE2L2、UBC、SQSTM1、CUL3、MYC、MAFG和CREBBP等。故本研究对采用实时荧光定量PCR方法检测肺癌患者血清中KEAP1、NFE2L2、UBC、SQSTM1、CUL3、MYC、MAFG和CREBBP基因拷贝数,比较它们在肺癌患者和健康志愿者之间的差异,以及与各种临床病理特征的关系,探讨KEAP1-NFE2L2基因在肺癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究使用2021年9月—2022年2月在我院住院的肺癌患者和健康志愿者的血液样本进行。根据纳入排除标准,最终入组15例患者[男11例和女4例,平均年龄(65.40±9.60)岁]作为肺癌组。根据 WHO 和 UICC TNM 分期系统(第 8 版)的标准确定每个癌样本的 TNM 分期[9]。所有患者均符合以下纳入标准:(1)所有患者均经病理确诊为肺癌,无既往或共存癌症;(2)临床资料完整。同时将15例接受体检的健康志愿者[男10例,女5例;平均年龄(62.10±9.11)岁]纳入对照组。对照组纳入标准如下:无肺癌临床症状(如咳嗽、咯血、呼吸困难和体重减轻等);(2)无恶性肿瘤家族史;(3)无心、肝、脾、肺、肾等主要脏器疾病。所有样本均经我院医学伦理委员会批准并征得患者知情同意。

1.2 PCR测定目的基因mRNA表达和CNV 采用血液样品总 RNA小量提取试剂盒(R4163-02,美基生物)从血液样品中提取总 RNA。使用HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01,诺维赞)进行反转录成cDNA。详细如下:加入1 μg的总 RNA到反转录管中,加入10μl的2× HiScriptⅡQ RT SuperMix,混匀,放入热循环仪进行反转录。反转录程序为50℃,15min;85℃,5s,然后保持4℃。使用2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02,诺维赞)进行目的基因 PCR 扩增。首先在PCR管中加入2μl的cDNA模板,加入10μl的2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,加入目的基因的特异引物(浓度为10μmol/L),加入RNase-free水至总体积为20μl。混匀后进行PCR扩增。PCR循环条件:通过初始95℃、5min开始热循环,然后是 95℃、15s,57℃、15s和72℃、20s的35个循环。qPCR 使用 荧光定量 PCR 仪(qTOWERE3,德国 AnalytikJena)进行,每个拷贝数由 CopyCaller v1.0(Thermo Fisher Scientific)使用CT 方法计算。引物由北京擎科生物技术有限公司(南宁) 进行合成,见表1。

表1 引物序列信息

1.3 标本采集和肿瘤标志物的检测 抽取所有受试者(包括肺癌组和健康对照组)的清晨空腹静脉血5ml。随后,将血液样本在4℃下以2 500g离心15min,之后收集血浆并储存在-80℃直到进一步分析。在自动化学发光分析仪(上海罗氏诊断产品有限公司,中国)上通过罗氏电化学发光法分析5种肿瘤生物标志物(CYFRA21-1、CEA、CA125、CA153h和CA199),所有测定程序均根据制造商的说明进行,校准溶液和试剂均为制造商的原装试剂盒。参考区间:CA125为0～35U/ml,CYFRA21-1为0～3.3ng/ml,CEA为0～5μg/L,CA153为0 ～25U/ml,CA199为0～27U/ml。

2 结果

2.1 研究人群 15例肺癌患者的临床病理参数见表2,患者年龄为49～84岁,大多数患者为男性,超过一半的患者吸烟。大多数患者被诊断为腺癌或鳞状细胞癌,大多数患者被诊断为肿瘤分期为Ⅳ期,其中Ⅰ～Ⅲ期各1例,5种肿瘤标志物的水平详见表2。

表2 15例肺癌患者临床病理参数

2.2 琼脂糖凝胶电泳结果 待测样本经荧光定量 PCR,电泳条带(见图1)单一,结果比较理想。

表3 肺癌患者与健康对照组目的基因mRNA表达和相对拷贝数的比较

2.3 肺癌患者与健康对照组目的基因mRNA表达和相对拷贝数的比较 NFE2L2、NFE2L2拷贝数、SQSTM1、MYC和 MYC拷贝数与肺癌呈现明显的相关性。肺癌组NFE2L2、SQSTM1、MYC表达显著高于对照组(P<0.05),而NFE2L2和MYC的拷贝数显著低于对照组(P<0.05)。但两组其他目的基因表达及拷贝数比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。

2.4 NFE2L2和MYC基因相对拷贝数与肺癌患者临床病理特征的关系 如表4所示,NFE2L2拷贝数与CYFRA21呈明显正相关(P<0.05),而与NFE2L2基因表达呈明显负相关(P<0.05)。NFE2L2基因表达与CYFRA21 基因表达和NFE2L2拷贝数呈明显负相关(P<0.05),而与KEAP1、SQSTM1、CUL3和CREBBP基因表达呈明显正相关(P<0.05)。MYC拷贝数与KEAP1拷贝数呈正相关(P<0.05),与MAFG、MYC和KEAP1基因表达呈现负相关(P<0.05)。MYC基因表达与CREBBP拷贝数、KEAP1拷贝数、MYC拷贝数呈明显负相关(P<0.05),而与病理类型、KEAP1、CUL3和CREBBP基因表达呈明显正相关(P<0.05)。

图1 目的基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析

表4 NFE2L2和MYC基因相对拷贝数与肺癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

肺癌是一种复杂的疾病,其发生和发展涉及多重因素和信号调控机制。因此,肺癌的预测和诊断也需要综合考虑多个指标。近期的研究表明,基因的拷贝数异常在肺癌的发展机制中扮演着重要的角色。例如,Heo等人的研究发现5个基因拷贝数异常(ACOT1、NAA60、GSDMD、HLADPA1和SLC35B3)和非小细胞肺癌之间存在显著关联,证实基因的拷贝数和肺癌的发展机制有关[10]。此外,Kou Fan等人的研究表明体细胞拷贝数可以和肿瘤的原发灶、淋巴结和远处转移分期联合用于预测早期肺腺癌患者接受放疗后的无进展生存期[11]。Reika等人的研究则表明MYC拷贝数的增加和小细胞肺癌和肺腺癌的预后不良有关[12]。Sunpaweravong等人的研究表明HER2基因扩增或17号染色体拷贝数增加以及c-Myc的高表达与总生存率下降有关[13]。类似的,本研究也发现,与对照组相比,MYC和NFE2L2的拷贝数在肺癌组更高,由此可以推测MYC和NFE2L2或许可以作为肺癌的发展的生物标志物。然而值得注意的是,MYC的相对拷贝数与NFE2L2相对拷贝数没有相关性,这提示了基因拷贝数在肺癌的发展中可能存在不同的调控机制。

MYC是一个重要的转录因子,可以调节许多基因的表达,包括调节中央代谢途径、细胞增殖、分化、细胞死亡以及应激途径和耐药机制等。此外,先前的研究表明,MYC的过表达可以与其他基因的激活或丧失相结合,从而促进癌细胞的生长和转移[14]。此外,Ireland的研究显示MYC与NOTCH可能相互合作,驱动小细胞肺癌的发展[15]。本研究显示,MYC的拷贝数和KEAP1拷贝数呈正相关,这一发现与先前的研究结果一致,表明MYC的作用不仅限于单个通路,而是涉及多个信号通路的调节和影响。尽管我们尚未探索MYC与KEAP1之间的具体作用机制,但本研究结果表明,MYC可能通过不同的机制调节多个基因和通路,促进肿瘤的生长和发展。

近年来,越来越多的研究表明NFE2L2与肺癌发生机制之间存在密切关系。在Binkley的研究中证实了NFE2L2可以预测接受放射治疗的非小细胞肺癌患者的局部复发率[14]。另外,Ju等人[16]实验显示NEF2L2的表达水平与5个错配修复系统(Mismatch repair system,MMR)的基因突变水平呈正相关。因此,NFE2L2的异常表达可能通过调节MMR基因突变水平和DNA甲基化等方式在肿瘤发生机制中发挥重要作用[16]。本研究结果也支持了NFE2L2在肺癌发生过程中的重要作用。具体而言,NFE2L2的相对拷贝数和细胞角蛋白十九片段CYFRA21-1呈现正相关,这表明NFE2L2的异常表达可能与肺癌细胞增殖和浸润的程度相关。

肺癌的发生和发展是由多个基因异常和环境因素共同作用引起的,其中MYC和NFE2L2基因被认为是肺癌的关键基因之一,其在肺癌的发生和发展中发挥了重要作用。一些研究表明,基因的拷贝数增加可能是肺癌侵袭性表型的标志,而MYC基因的拷贝数与小细胞肺癌和腺癌的预后不良有关[1]。然而,本研究中并未涉及患者的生存时间数据,因此无法对基因的拷贝数与患者生存情况之间的关系进行分析。本研究的另一个局限性是分析样本数量较少,因此无法进行更精确的数据分析。

综上所述,MYC和NFE2L2基因在肺癌的发生和发展过程中发挥着重要作用,因此深入研究这两个基因在肺癌中的作用,进一步分析其对肺癌患者的预后作用,将有助于提高肺癌患者的治疗效果,延长患者的生命,为肺癌患者的治疗提供更好的理论基础和实践指导。