朱羽君

南阳医学高等专科学校基础医学部,河南省南阳市 473061

梗阻性黄疸(Obstructive jaundice, OJ)是由各种原因引起的以胆汁淤积、肝胆组织受损等一系列病理生理改变为主的临床症候群[1-2]。枸杞是我国传统中药方剂中的常用配方成分,味甘、性平,具有延缓衰老、明目安神、抗疲劳等多种保健功效,其中枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide, LBP)是枸杞发挥功效的主要成分[3]。研究表明,LBP有明显的肝细胞保护活性,且无毒副作用[4-5],LBP还具有抗氧化活性以及对线粒体的保护作用等[6]。本研究以梗阻性黄疸小鼠为研究对象,通过LBP实施干预,观察肝功能总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)指标及肝组织中TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α表达的变化,为梗阻性黄疸患者保肝方案提供新的治疗线索,也为枸杞中药资源的开发利用提供新的研究方向。现将相关结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 纳入成年健康雄性昆明小鼠60只,体质量(20±2)g,实验小鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,适应性喂养1周。

1.2 主要实验试剂及仪器 枸杞多糖(购于宁夏启元药业),0.9%NaCl,冰醋酸,EDTA,苏木素,多聚甲醛,松节油等试剂,TBIL、ALT、AST 试剂盒,DAB 染色液,NF-κB P65,TNF-α一抗,PCR仪,核酸蛋白检测仪,高速低温离心机等。

1.3 方法 采用随机数字表法将60只小鼠分为3组,即假手术组(Blank control group, B组)、模型组(Model group, M组)和枸杞组(Lycium barbarum polysaccharide group,L组),每组20只。

模型组和枸杞组行胆总管结扎致肝损伤构建梗阻性黄疸模型,采用张守华等[7]构建黄疸模型的方法并加以改良。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰卧位固定于手术台,备皮,消毒铺巾。在上腹部正中做切口,进入腹腔并提出十二指肠,找到并暴露胆总管,用不可吸收手术丝线将胆总管悬挂于腹壁,依次缝合手术伤口。48h后剪断胆总管固定线。之后枸杞组于手术后2d行固定时间枸杞多糖500mg/(kg·d)灌胃,连续给药6周。假手术组小鼠只进行腹部切开手术,不进行模型构建和枸杞多糖干预即空白对照组。

1.4 观测指标

1.4.1 标本采集与处理:用消毒后的手术剪行腹腔切口后,分离出肝脏组织,并进行分解,10%甲醇溶液固定后石蜡包埋切片,用于免疫组化分析。

1.4.2 肝功能指标检测:采用生物化学分析法检测血清中TBIL、ALT、AST等肝功能指标的浓度,操作方法参照试剂盒说明书。

1.4.3 免疫组织化学染色:采用链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物组织化学染色法(Strept Avidin-Biotin Complex, SABC)检测小鼠肝脏组织中TNF-α的表达,采用Realtime-PCR技术检测NF-κB、IKK-α、IκB-α的表达水平,操作方法按照试剂盒说明书步骤进行。

2 结果

2.1 一般情况及肉眼观察 在建模的6周时间内,三组小鼠均未出现由建模或喂养或其他原因导致死亡的情况。建模成功后假手术组小鼠的食欲、生长均正常;随着梗阻时间的增加,模型组和枸杞组小鼠的活跃度降低,出现嗜睡,尿液颜色逐渐变黄,建模成功约2d后小鼠的皮肤、毛发、耳尖等部位出现局部发黄现象;而经过一段时间的干预后,枸杞组小鼠的症状均轻于模型组小鼠。

2.2 各组肝功能指标比较 模型组小鼠血清TBIL、ALT、AST水平处于三组的最高水平,枸杞组的TBIL、ALT、AST水平较模型组有明显降低,差异均有统计学意义(t=14.863、5.324、5.232,均P<0.001);但枸杞组的TBIL、ALT、AST水平仍然分别高于假手术组,差异均有统计学意义(t=11.341、10.864、30.105,均P<0.001)。见表1。

表1 各组肝功能指标比较

2.3 各组TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α指标比较 模型组小鼠肝组织中TNF-α、NF-κB、IKK-α的表达处于三组的最高水平,枸杞组的TNF-α、NF-κB、IKK-α表达水平较模型组有明显下调,差异均有统计学意义(t=-7.471、-15.583、-22.856,P<0.001);但枸杞组的TNF-α、NF-κB、IKK-α表达水平仍然分别高于假手术组,差异均有统计学意义(t=5.981、6.001、14.381,均P<0.001);而IκB-α的表达水平则呈完全相反的趋势,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组TNF-α、NF-κB、IKK-α、IκB-α指标比较

3 讨论

目前研究认为 OJ的主要发病机制是由于肝脏的内外胆管因内部压力原因造成的完全或不完全梗阻,进而引发肝脏清除内毒素的能力急剧降低[8]。当梗阻长期存在时,可能引起胆管组织的纤维化,进一步加剧胆汁的流动受阻,尤其是患者还合并有胆道感染时,胆管还会出现萎缩、炎性细胞浸润等并发症[9]。梗阻也会使得肝窦的血液流动受阻,进而导致继发性的门静脉高压,最终导致肝脏损伤[10]。

ALT、AST是肝内主要的功能酶,主要存在于肝细胞内,当出现肝脏细胞膜损伤或肝细胞坏死等情况时,ALT、AST会流入血液中,使血清中的转氨酶水平升高。TBIL是直接胆红素和间接胆红素的总和,当肝脏功能出现发生障碍时,会引起TBIL在血液中积聚,进而发生黄疸症状。本组研究发现,模型组小鼠血清的TBIL、ALT、AST水平处于三组的最高,而经枸杞多糖干预后的小鼠TBIL、ALT、AST水平较模型组有明显降低,但仍然高于假手术组(空白对照组)。这提示枸杞多糖对梗阻性黄疸肝损伤有明显的改善和保护作用,同时对减轻肝脏纤维化具有促进作用。刘翔探讨黄芪多糖与枸杞多糖联用对小鼠肝组织损伤的保护作用也发现,枸杞多糖对四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤有明显的保护作用[11]。

近年来关于细胞因子与免疫功能相关关系的研究显示[12-13],当机体发生梗阻性黄疸时肝脏内的TNF-α等细胞因子的过量表达,促使炎症反应的加速,是导致继发性肝损伤的重要原因。本研究中,枸杞组的TNF-α、NF-κB、IKK-α表达水平较模型组有明显下调,但高于假手术组,而IκB-α的表达水平则呈完全相反的趋势,提示通过6周枸杞多糖灌胃干预后,下调了梗阻性黄疸肝损伤小鼠机体内TNF-α、NF-κB、IKK-α表达水平,上调了IκB-α的表达水平,通过减少与其下游的信号分子的结合,从而控制了小鼠体内的炎症反应,改善和保护了肝功能的损伤[14]。提示枸杞多糖的干预通过抑制TNF-α所介导的NF-κB信号通路,进而在梗阻性黄疸肝损伤的改善及保护中起到关键作用[15]。

综上所述,枸杞多糖干预对梗阻性黄疸小鼠的肝功能具有保护作用,能有效改善肝损伤小鼠的肝功能和免疫功能,可能通过抑制肿瘤坏死因子α介导的核转录因子κB信号通路发挥作用。