刘延忠 ，贾新梅 ，郭洪章 ，王雪莲 ，刘东升 （1.甘肃省药品监督管理局信息中心统计咨询科，兰州 70070；.武威市中医医院药剂科，甘肃 武威 7000；.甘肃省中医院消化内科，兰州 7000；.甘肃省药品监督管理局审核查验中心药品检查科，兰州 70070；.甘肃省药品检验研究院中成药检验研究室，兰州 70070）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种慢性功能性胃肠道疾病，主要分为4 种类型：腹泻型IBS、便秘型IBS（constipation-predominant irritable bowel syndrome，IBS-C）、混合型IBS 和未分类IBS[1]。其中，IBS-C 约占IBS 的三分之一，以腹痛、排便不尽、排便习惯改变等为主要表现，虽不造成任何器质性病变和生化指标异常，但会严重影响患者（尤其是功能性肠道疾病患者）的生活质量和工作效率[2]。研究指出，与西药治疗相比，中药治疗能更好地缓解IBS 患者的相关症状，同时可使其复发率更低[3]。可见，有必要不断探索可有效治疗IBS-C的中药。

有“沙漠人参”之称的中药肉苁蓉来源于列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY. C. Ma 或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 的干燥带鳞叶的肉质茎，具有温肾通便、调节内分泌、保护神经等药理作用；其活性成分之一的肉苁蓉多糖（以下简称“CDPS”）可调节肠道菌群结构和组成，促进益生菌生长，对维持肠道健康具有重要作用[4]。研究表明，CDPS可通过恢复肠道微生物群失调来缓解衰老小鼠的认知能力下降[5]，但其对IBS-C的具体作用尚不明确。

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是一种原型神经营养因子，具有维持和诱导外周神经细胞分化的能力，可作用于中枢神经系统、免疫系统和内分泌系统；原肌球蛋白受体激酶A（tropomyosin receptor kinase A，TrkA）是受体酪氨酸激酶家族的关键成员，也是NGF的同源受体[6]。研究发现，NGF介导的TrkA信号转导与炎症相关的内脏痛觉过敏的发展有关，且NGF、TrkA 在IBS 患者结肠黏膜组织中的表达均明显上调，故抑制NGF 可能是治疗该症的重要策略[7]；另一项基于脊髓损伤白化大鼠的研究发现，肉苁蓉提取物中的低聚糖能通过激活NGF 前体来发挥抗炎、抗氧化应激、抗凋亡作用[8]。由此可见，肉苁蓉的糖类提取物（如CDPS）可能对NGF 介导的信号通路具有一定的调控作用。为验证这一假设，本研究拟基于NGF/TrkA 信号通路探讨CDPS对IBS-C 大鼠的影响，以期为探索更多有效治疗IBS-C的方案提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括SpectraMax iD5 型多功能微孔酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]，E100型光学显微镜（日本Nikon 公司），CFX96 Touch 型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪、ChemiDoc MP型全能成像系统[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]等。

1.2 主要药品与试剂

CDPS[货号BJ-1962，规格200 mg（每克相当于生药12.61 g）]购自北京凯诗源生物科技有限公司；枸橼酸莫沙必利片[阳性对照，批号20220824，规格5 mg（按C21H25ClFN3O3·C6H8O7计算）]购自江苏豪森药业集团有限公司；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（货号E-IR-R117）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；RNA提取试剂（Trizol法）、两步法实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）试剂盒（货号分别为R401-01、R232-01）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；兔源NGF、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体和兔源TrkA 单克隆抗体（货号分别为ab6199、ab9485、ab302524）均购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗（货号FNab09778）购自武汉菲恩生物科技有限公司；5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（货号EK-H12226）购自上海酶研生物科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体重（200±20）g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，动物生产许可证号为SYXK（甘）2020-0002。所有大鼠均在26 ℃、60%相对湿度的环境下饲养，并自由摄食、饮水。本实验方案经武威市中医医院医学伦理委员会审核批准，批号为2022伦审0003号。

2 方法

2.1 大鼠模型的建立与分组

所有大鼠适应性饲养1 周后，将其分为对照组（20只）和造模组（90 只）。对照组大鼠正常饲养；造模组大鼠参照文献方法[9]，每天上午8：00灌胃0～4 ℃生理盐水2 mL，连续14 d，以建立IBS-C 大鼠模型。末次灌胃结束后，所有大鼠禁食禁水4 h，记录这4 h 内各组大鼠的粪便颗粒数，并根据Bristol粪便性状分型量表[10]进行评分，若粪便颗粒数、Bristol 评分均显著低于对照组则表明造模成功。由于造模期间，造模组大鼠有2只死亡，5只的粪便颗粒数、Bristol评分与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），故本研究随机选择造模成功的80只大鼠，分为模型组、阳性对照组、CDPS 低剂量组、CDPS高剂量组，每组20只。阳性对照组大鼠灌胃枸橼酸莫沙必利混悬液1.35 mg/kg（以水为溶剂）[11]，CDPS低、高剂量组大鼠分别灌胃CDPS 混悬液50、100 mg/kg（以水为溶剂）[5]，对照组和模型组大鼠均灌胃等体积水，每天1次，持续28 d。

2.2 大鼠粪便含水量检测

给药期间，每天清理大鼠粪便；末次给药结束后，将大鼠放入代谢笼中，收集其排泄的新鲜粪便并置于无菌管中称重（即新鲜粪便质量）；随后，将粪便干燥24 h（80 ℃），再次称重（即干燥粪便质量）并按下式计算粪便的含水量：含水量＝（新鲜粪便质量-干燥粪便质量）/新鲜粪便质量×100%。

2.3 大鼠血清中5-HT含量检测

采用ELISA法进行检测。粪便含水量检测结束后，将大鼠用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，于腹主动脉采血2 mL，离心后分离上层血清，置于-20 ℃保存，备用。取各组大鼠上述血清样品，采用ELISA法以酶标仪检测其5-HT含量。严格按照相应试剂盒说明书操作。

2.4 大鼠肠道炭末推进率检测

采用炭末推进法进行检测。采血后，从每组大鼠中随机选取5只，禁食不禁水24 h后，灌胃5%活性炭和4%阿拉伯胶混悬液（二者体积比1∶2）10 mL/kg；30 min后，用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，以颈椎脱位法处死，打开腹腔取出完整的肠道组织，平放在吸水纸上，测量肠管长度（即小肠全长）和幽门至炭末前沿的距离并按下式计算炭末推进率：炭末推进率＝幽门至炭末前沿的距离/小肠全长×100%。

2.5 大鼠结肠组织病理形态观察

采用HE 染色法进行观察。将各组剩余大鼠用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，以颈椎脱位法处死，取出其结肠组织于-80 ℃冻存。从每组样品中随机选取5只小鼠的组织样品，放入4%多聚甲醛中固定过夜，随后行常规石蜡包埋、切片；切片以HE 染色后，再以梯度乙醇脱水、二甲苯透明，以中性树脂封片后，使用显微镜观察各组大鼠结肠组织的病理形态。

2.6 大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA表达检测

采用qRT-PCR 法进行检测。从“2.5”项下冻存的每组样品中随机选取另5 只小鼠的结肠组织样品，利用Trizol 法提取RNA，再利用反转录试剂将其反转录为cDNA；以cDNA 为模板进行PCR 扩增，反应体系包括：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（具体序列及产物长度见表1）各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，加ddH2O 至20 μL。反应程序包括：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR引物及产物长度

2.7 大鼠结肠组织中NGF、TrkA蛋白表达检测

采用Western blot法进行检测。从“2.5”项下冻存的每组样品中选取剩余5只小鼠的结肠组织样品，放入匀浆器中，加入蛋白裂解液匀浆并提取总蛋白，以BCA测定法进行蛋白定量后再作变性处理。取变性蛋白适量，以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至聚偏二氟乙烯膜上，然后以5%脱脂奶粉于4 ℃下封闭过夜；加入NGF、TrkA、GAPDH 一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶2 500），室温孵育2 h；加入相应二抗（稀释比例为1∶1 000），室温孵育2 h；再以ECL试剂避光显色后，于全能成像系统下成像。以GAPDH为内参，使用Image J软件分析目的蛋白的相对表达量。

2.8 统计学方法

利用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析。计量资料均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 CDPS对大鼠粪便含水量的影响

与对照组比较，模型组大鼠的粪便含水量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠的粪便含水量均显著升高（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠的粪便含水量、血清5-HT含量和炭末推进率比较（±s）

表2 各组大鼠的粪便含水量、血清5-HT含量和炭末推进率比较（±s）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组阳性对照组CDPS低剂量组CDPS高剂量组粪便含水量（n＝20）/%60.54±3.11 38.42±2.15a 58.83±2.64b 47.16±2.38ab 59.21±2.93b 5-HT（n＝20）/（ng/mL）40.28±2.76 63.41±4.12a 43.16±3.24b 55.62±3.41ab 42.83±3.32b炭末推进率（n＝5）/%74.65±3.41 51.34±2.38a 72.46±3.23b 63.20±2.81ab 73.79±3.26b

3.2 CDPS对大鼠血清中5-HT含量的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清中5-HT 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠血清中5-HT含量均显著降低（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

3.3 CDPS对大鼠炭末推进率的影响

与对照组比较，模型组大鼠的炭末推进率显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠的炭末推进率均显著升高（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

3.4 CDPS对大鼠结肠组织病理形态的影响

对照组大鼠的结肠组织结构完整，黏膜层腺体排列整齐，无明显炎症细胞浸润；与对照组比较，模型组大鼠的结肠组织黏膜肌层出现断裂，腺体紊乱，炎症细胞浸润和细胞水肿明显；与模型组比较，阳性对照组和CDPS低、高剂量组大鼠的结肠组织形态逐渐恢复，黏膜层腺体排列较规则，炎症细胞浸润和细胞水肿明显减轻，其中阳性对照组、CDPS 高剂量组的形态与对照组较为接近。结果见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理形态的显微图

3.5 CDPS 对大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA 水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA 的相对表达量均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA的相对表达量均显著降低（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠结肠组织中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相对表达量比较（±s）

a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。

组别对照组模型组阳性对照组CDPS低剂量组CDPS高剂量组mRNA（n＝5）NGF 0.59±0.04 1.03±0.08a 0.63±0.04b 0.85±0.06ab 0.62±0.05b TrkA 0.48±0.03 0.99±0.07a 0.52±0.04b 0.74±0.05ab 0.51±0.03b蛋白（n＝5）NGF 0.79±0.05 1.45±0.09a 0.84±0.07b 1.16±0.08ab 0.83±0.06b TrkA 0.67±0.04 1.38±0.08a 0.71±0.06b 1.08±0.07ab 0.69±0.05b

3.6 CDPS 对大鼠结肠组织中NGF、TrkA 蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠结肠组织中NGF、TrkA蛋白的相对表达量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，各药物组大鼠结肠组织中NGF、TrkA 蛋白的相对表达量均显著降低（P＜0.05），且阳性对照组和CDPS高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3、图2。

图2 各组大鼠结肠组织中NGF、TrkA蛋白表达的电泳图

4 讨论

IBS是一种常见的胃肠道疾病，其特征以腹部不适、腹痛反复发作并伴排便习惯改变为主，严重降低了患者的生活质量[12]。学界普遍认为，IBS-C 的发病机制与自主神经系统功能障碍、内脏高敏感性、肠道细菌过度生长和肠道炎症等有关，然而能有效改善IBS-C患者症状的上市治疗方案很少[13]。IBS-C 属中医“便秘”范畴，病因为脾虚气弱、肝郁不畅、郁而化火，从而致大肠传导功能异常[14]。肉苁蓉是一种可增强机体肠道蠕动、提升免疫力、抗衰老、抗氧化的功能性药用植物。CDPS作为其主要活性成分，不仅具有调节免疫、抗氧化和抗炎等多种生物活性，而且在改善老年人便秘方面也有较大潜力[15]，但该组分对IBS-C 的作用尚不明确。枸橼酸莫沙必利是消化道促动力剂，常用于改善功能性消化不良、慢性胃炎伴烧心、嗳气、恶心、呕吐、早饱、上腹胀、上腹痛等消化道症状[16]。基于此，本研究建立了IBS-C 大鼠模型，并以枸橼酸莫沙必利为阳性对照，结果显示，模型组大鼠的粪便含水量和炭末推进率均较对照组显著降低，结肠组织黏膜肌层出现断裂，腺体紊乱，炎症细胞浸润和细胞水肿明显；而各药物组大鼠的粪便含水量和炭末推进率均较模型组显著升高，结肠组织损伤有所减轻，上述指标（CDPS低剂量组除外）与对照组相当，组织形态（CDPS低剂量组除外）逐渐接近于对照组。这提示CDPS可软化IBS-C模型大鼠的粪便，促进粪便排出，从而缓解结肠组织的病理改变，高剂量CDPS 的作用与阳性对照药物相当。

内脏超敏反应是IBS 的重要病理生理变化之一，与腹痛有关，可涉及神经系统的多个层次，如包括NGF 在内的多种神经内分泌介质[17]。NGF 是神经营养因子家族的重要成员，参与了内脏超敏反应过程，可导致内脏疼痛阈值降低[18]。研究显示，NGF可诱导肠道干细胞增生，并驱动其扩增、分化为分泌细胞，从而促进神经递质5-HT 高表达，最终导致内脏痛觉敏感和胃肠道运动加剧[18]。TrkA 是NGF 的高亲和力受体，两者结合后可调节下游信号通路（如促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信号调节激酶通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路等），从而促进神经递质的释放、突触受体的表达和神经可塑性的改变[19]。研究显示，通泻安肠汤可通过抑制NGF/TrkA 信号通路来减轻腹泻型IBS 大鼠的内脏高敏感性[17]。本研究结果显示，模型组大鼠血清中5-HT含量和结肠组织中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相对表达量均显著高于对照组，而各药物组大鼠血清中5-HT 含量和结肠组织中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相对表达量均显著低于模型组，且阳性对照组和CDPS 高剂量组上述指标与对照组比较差异均无统计学意义。这提示CDPS可抑制NGF/TrkA 信号通路的激活，减少5-HT 的产生，减轻IBS-C大鼠的内脏高敏感性和胃肠道运动，从而抑制IBS-C的发展。

综上所述，CDPS能够缓解IBS-C大鼠的症状，其作用可能与NGF/TrkA信号通路被抑制有关。本研究初步证实了CDPS 对IBS-C 具有潜在的治疗作用，并提供了相关理论依据。然而有研究发现，CDPS 能够通过激活Wnt/β-联蛋白信号通路来预防骨质疏松，同时该通路的激活增加了NGF的分泌[20—21]。但关于这两种信号途径在IBS-C发生发展中的级联反应还有待深入探索。