耿雅雯,何丽娟,彭婷婷,丘峻朝,阎升光**,欧阳石,**

(1.华北理工大学公共卫生学院,唐山 063000;2.开滦总医院妇产科,唐山 063000;3.广州医科大学附属第五医院 a.感染性疾病科;b.产科,广州 510000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是威胁全人类健康、具有高度传染性的疾病,据世界卫生组织估计,全球约有35亿人感染HBV,每年有88.7万人死于HBV感染引起的肝硬化、肝癌和肝衰竭,而母婴传播(mother to child transmission,MTCT)是最常见的感染途径之一[1-2]。中国育龄妇女乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)的流行率为5.76%。研究发现,较高的HBV DNA是导致HBV阻断失败的原因之一,故国内外指南均明确HBV DNA≥2×105IU/mL的孕妇应预防性使用核苷类似物抗病毒药物,以阻断母婴传播[3-7]。但目前我国超过70%的HBV感染孕妇在孕早中期处于低病毒载量状态[8-9]。文献显示,孕妇会在妊娠期出现病毒载量升高,导致部分孕妇在孕晚期出现高病毒血症、暴露于母婴传播的风险中,发生率为9%～40%[10-13]。因此早期识别妊娠期HBV DNA升高的危险因素并科学随访监测是实现2030年HBV母婴“零传播”目标的工作重点。目前相关HBV DNA升高率及危险因素在全球均无系统性研究,国内外指南对于孕早中期HBV DNA低于2×105IU/mL孕妇尚无明确的随访建议。本研究通过探讨低载量HBV DNA孕妇妊娠期病毒载量升高和出现高病毒血症的临床特点并分析其危险因素,为临床的早期识别、建立规范化随访体系并及时启动抗病毒治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2020年1月至2022年9月就诊于广州医科大学附属第五医院的251例低病毒载量HBV感染孕妇的临床资料。纳入标准:(1)连续6个月HBsAg阳性;(2)临床资料完整,有两次及以上HBV DNA检测且间隔至少8周;(3)孕12～24周HBV DNA<2×105IU/mL。排除标准:(1)孕前或孕24周前口服药物抗病毒治疗;(2)严重全身疾病,如心血管、肾脏、呼吸系统、神经系统等并发症;(3)存在自身免疫性肝病、肝癌患者或正在使用免疫抑制剂;(4)合并其他传染病,如甲丙丁戊庚型肝病、艾滋病、梅毒等。

1.2 研究方法 采用回顾性巢式病例对照研究。以乙肝低病毒载量(HBV DNA<2×105IU/mL)孕妇为队列人群,以孕32周～分娩为队列终点,研究妊娠期HBV DNA升高的影响因素。将病毒载量升高孕妇再分为≥2×105IU/mL组和<2×105IU/mL组,分析高病毒血症发生的危险因素。

1.3 观察指标 (1)基本特征:年龄、胎次、孕前BMI;(2)血清学病毒学检测:HBV DNA,HBsAg,乙肝e抗原(Hepatitis B e Antigen,HBeAg);(3)生化学指标:丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、血脂;(4)其他:合并症情况、分娩方式、新生儿出生体重、身长、Apgar评分、HBV感染情况等。

1.4 研究指标检测方法及定义 (1)HBV DNA:采用乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法,中山大学达安基因有限公司),以HBV基因组中相对保守区为靶区域,在血清或血浆样本核酸纯化之后,使用荧光定量PCR仪进行PCR扩增,并检测荧光信号。仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线,根据阈循环值(CT值)实现对样本的定量检测。最低检出限浓度为30IU/mL,最低定量浓度(即定量下限)为100IU/mL,定量上限为5.00E+08IU/mL,灵敏度30IU/mL。检测结果<100IU/mL判定为阴性,≥100IU/mL判定为阳性。HBV DNA上升定义:HBV DNA上升1个对数值或从阴性转到阳性;HBV DNA下降定义:HBV DNA下降1个对数值或从阳性变为阴性。(2)乙肝两对半(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb):(cobas e 601分析仪,罗氏诊断产品有限公司),通过化学发光法检测下限界限值分别为(0.05IU/mL、10mIU/mL、1.00s/co、1.00s/co、1.00s/co);检测结果HBeAg<1.00s/co为HBeAg阴性;HBeAg≥1.00s/co为HBeAg阳性。(3)FIB-4[14]:计算公式为AST[IU/L]×年龄[岁]/血小板计数[109/L]/ALT[IU/L]1/2,用于反映肝纤维化和肝硬化;FIB-4小于1.45者无明显肝纤维化或只有2级以下肝纤维化;FIB-4大于3.25者肝纤维化高于2级。(4)基线时间:孕12～24周。以中华医学会感染病学分会发布最新乙肝母婴临床管理指南[15]中建议:应在妊娠中期(12～24周)检测HBV DNA水平为依据。

1.5 随访 对高病毒血症妇女分娩孩子行电话随访,根据家长的描述填写孩子喂养情况、一般特征和HBV感染情况。

2 结 果

2.1 一般资料 251例低病毒载量乙肝孕妇中,84.46%孕期HBV DNA稳定,15.54% HBV DNA升高,3.19%升高至高风险。患者年龄(30.67±4.25)岁、孕前体质量指数(body mass index,BMI)(20.77±2.84)kg/m2、头胎占比46.6%(117/251)。HBV DNA升高组孕妇中ALT≥19U/L比例高于非升高组(43.3% vs 20.1%,P<0.05),合并贫血比例低于非升高组(17.9% vs 37.7%,P<0.05),见表1。

2.2 HBV DNA升高组和非升高组孕妇乙肝病毒学比较 两组孕妇基线HBV DNA比较,差异无统计学意义(P>0.05);HBV DNA升高组孕妇HBeAg阳性率高于非升高组,差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。将单因素分析显示对两组有差异的因素和考虑与病毒载量升高的因素纳入进行多因素分析。结果显示,HBeAg阳性(OR=6.31,95%CI为1.44～27.63,P<0.05)和ALT≥19U/L(OR=2.79,95%CI为1.12～6.95,P<0.05)是妊娠期HBV DNA升高的独立危险因素,妊娠合并贫血为保护因素(OR=0.30,95%CI为0.10～0.88,P<0.05)(图1)。

表2 HBV DNA上升组与非上升组乙肝病毒学比较

2.3 HBV DNA上升孕妇亚组分析 8例妊娠期出现高病毒血症孕妇。与未出现高病毒血症孕妇比较,高病毒血症孕妇的平均年龄小,小于30岁占比大,头胎比例高,HBeAg阳性率高,基线HBV DNA均≥100IU/mL比例高,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、4。

表3 妊娠期HBV DNA升高孕妇亚组临床特点及新生儿情况比较

表4 HBV DNA升高孕妇亚组乙肝病毒学分析

2.4 不同基线HBV DNA孕妇妊娠期出现高病毒血症情况 基线HBV DNA<100IU/mL的孕妇几乎不会上升至高风险,HBV DNA≥100IU/mL的孕妇有出现高病毒血症的风险,100IU/mL≤HBV DNA<2×103IU/mL和1×104IU/mL≤HBV DNA<2×105IU/mL发生率分别为5.63%和28.57%(图2)。

图2 基线不同HBV DNA分组的孕妇妊娠期病毒载量上升为高风险的情况

2.5 发生高病毒血症孕妇分娩新生儿随访结局 2023年5月对8例高病毒血症孕妇分娩新生儿进行随访,7例完成电话随访,随访时中位年龄2岁(10月龄至2岁零4个月),均完成了标准乙肝免疫预防方案并有母乳喂养,家长未报告孩子有HBV感染,其中一例复查无抗体,后加种一针乙肝疫苗(表5)。

表5 7例出现高病毒血症孕妇分娩新生儿随访结局

3 讨 论

根据2021年我国《阻断乙型肝炎病毒母婴传播临床管理》[15]建议:应在妊娠中期(12～24周)检测HBV DNA水平,若孕妇HBV DNA≥2×105IU/mL应于孕28周给予TDF进行抗病毒治疗,但对于HBV DNA<2×105IU/mL孕妇尚无明确建议。本文乙肝低病毒载量(HBV DNA<2×105IU/mL)孕妇队列中,HBV DNA升高发生率接近1/6,且出现高病毒血症(HBV DNA≥2×105IU/mL)的占比高达3.19%。由此可见低病毒载量孕妇妊娠期HBV DNA升高的发生率并不低,甚至在孕晚期出现高病毒血症,而高载量HBV DNA(HBV DNA≥2×105IU/mL)孕妇所生婴儿即使完成主动和被动免疫,仍有10%～30%发生母婴阻断失败[16]。临床医生易忽视对该人群孕晚期HBV DNA的复测,而未能及时发现暴露于母婴传播高风险的人群。因此进一步探讨妊娠期病毒载量升高的预测因子发现:HBeAg阳性和孕12～24周ALT≥19U/L为HBV DNA升高的独立危险因素,该结果为临床诊疗计划提供了预测思路。本研究提示,低载量HBV DNA孕妇依据指南于孕12～24周检测HBV DNA后,需间隔4～6周且不晚于孕32周进行复测,必要时启动抗病毒治疗。尤其应关注具有HBeAg阳性和孕12～24周ALT≥19U/L特点的人群,或考虑预先予以抗病毒治疗以降低HBV母婴传播风险。

既往研究也提出乙肝孕妇在妊娠期有出现病毒载量升高的情况:Chang等[10]的多中心研究显示,90例孕妇中有8例(9%)出现HBV DNA升高。马庆庆等[17]前瞻性观察27例HBV感染孕妇发现其HBV DNA随着孕周增加呈上升趋势。有研究显示,4/16(25%)的孕妇妊娠期HBV DNA上升大于1log10[11]。Kushner等[12]研究主要观察妊娠期乙型肝炎活动的发生率,但也提出在妊娠期检测HBV DNA的115例患者中,6例(5%)在妊娠期HBV DNA比基线增加一个对数。Nguyen等[13]和Ter Borg等[18]研究也有相应结论。然而以上研究只有前两者以妊娠期病毒载量升高为主要观察指标,后三者均为其他研究目标的附带结果,况且纳入对象为全部乙肝孕妇,并未准确定位乙肝低病毒载量人群。但该人群是易被忽视且具潜在风险的群体,因此本研究以乙肝低病毒载量人群为队列,观察孕晚期病毒载量升高的发生率和可能预测指标,更加精确地定位了研究对象,为今后指南的补充提供一定参考价值。

本研究显示,妊娠期病毒量升高的预测因子为HBeAg阳性和孕12～24周ALT≥19U/L,与基线HBV DNA水平可能并无关系。既往相关报道虽少[19-20],但均与本研究结果一致。一项对352例乙肝孕妇HBV DNA水平的回顾性分析显示,HBeAg阳性状态可预测孕晚期更高的病毒载量[19]。2021年的系统分析总结,HBeAg阳性孕妇HBV DNA在妊娠期达到推荐的抗病毒治疗阈值(≥5.3 log10IU/mL)的概率为81.51%,与HBeAg阴性孕妇相比占比更大(P<0.05)[20]。其主要解释为:在HBV复制周期中,共价闭合环状DNA(Covalentlyclosed circle DNA,cccDNA)从HBV基因组中转化而来,并作为所有病毒转录物的模板存在于宿主细胞核中,同时与HBeAg阴性相比,HBeAg阳性患者超过95%的HBV转录物来自cccDNA(P=0.0097),故HBV DNA通常与cccDNA相关[21-22]。因此低病毒载量孕妇中,HBeAg阳性患者在妊娠期HBV DNA更易呈上升趋势。ALT预测孕期病毒升高并无相关研究报道,2022年《慢性乙型肝炎防治指南》[23]拟将女性ALT治疗阈值下调至19U/L,并强调ALT水平可在一定程度上反映肝细胞损伤程度。马庆庆等[24]提出,HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)孕妇在未经抗病毒治疗的情况下,可能存在肝细胞的损害。由此推测妊娠期HBV DNA变化与ALT水平可能存在相关。本研究还显示,妊娠合并贫血为妊娠期HBV DNA升高的保护因素,该结果有待进一步多中心、多样本的研究加以证实。

对HBV DNA上升人群亚组分析发现,与未出现高病毒血症孕妇相比,出现高病毒血症组孕妇年龄更小、头胎占比更大及HBeAg阳性占比大且基线HBV DNA均≥100IU/mL,差异均有统计学意义(P<0.05)。结果分析如下:年龄<30岁孕妇多数处于免疫耐受期(HBeAg阳性)[25],而HBeAg是临床中活性病毒复制的辅助标志物[26],因此年龄<30岁孕妇HBV DNA相对易升高至高风险;头胎占比更大可能与头胎孕妇更年轻有关。对基线病毒载量分析发现,100IU/mL≤HBV DNA<2×103IU/mL和1×104IU/mL≤HBV DNA< 2×105IU/mL的孕妇孕晚期出现高病毒血症的发生率分别为5.63%和28.57%。提示并非HBV DNA接近2×105IU/mL才易出现高病毒血症,只要HBV DNA阳性,即有发生的风险。本研究中发生高病毒血症孕妇分娩的新生儿均完成了标准乙肝免疫预防[主动免疫(出生0、1、6个月分别注射10μg重组酵母乙肝疫苗)]和被动免疫[出生时注射剂量≥100IU的乙肝免疫球蛋白(hepatitis-B immunoglobulin,HBIG)],均未发生HBV感染。本研究为单中心研究,样本量受限,尚不能排除发生HBV母婴传播的可能性。

综上所述,本研究妊娠期HBV DNA升高的发生率为15.54%,甚至3.19%升至高风险(HBV DNA≥2×105IU/mL)。HBeAg阳性和孕12～24周ALT≥19U/L为病毒载量升高的危险因素,这给低病毒载量孕妇中升高危险人群的识别和孕中后期建立规范化随访体系提供了有力证据,并为后续进一步的大量本研究奠定了基础。同时,迫切需要更多研究者的努力,为建立一个标准化的随访计划提供更多证据。

本研究的局限性:(1)以HBV DNA升至≥2×105IU/mL为病例组更具临床意义,但该现象发生率低,所需样本量较大,故本单中心研究预先进行升高人群探索,亚组分析高病毒载量人群,为后续进一步多中心大样本研究提供初步证据。(2)研究队列中有391例HBV感染孕妇未测或只测一次HBV DNA,存在失访偏倚和信息偏倚。但本研究结果至少可提示孕早中期低病毒载量孕妇在孕后期出现HBV DNA升高和高病毒血症并不罕见,一旦发生若不及时处理,将大大增加HBV母婴传播风险。(3)以电话随访、家属自行报告为乙肝母婴结局随访方式,存在报告偏倚。