王建凤，王泽昊，2，张艺楷，刘 艳*，冯月超*

（1．北京市科学技术研究院分析测试研究所（北京市理化分析测试中心），北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089；2．首都师范大学 化学系，北京 100048）

代谢组学利用高通量技术对生物体内代谢产物进行系统性分析。通过代谢组学研究，可以发现与疾病、环境、遗传等因素有关的代谢物的变化规律和代谢途径，从而为疾病的早期诊断和治疗提供新的思路和方法。相关研究主要使用的技术包括质谱、核磁共振和色谱等［1］。质谱是目前最常用的技术，其中气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术应用最为广泛［2］。目前代谢组学研究仍存在数据的丰富性和复杂性等挑战，因此，需要不断完善相应的研究技术和数据分析方法，进一步提高代谢组学研究的可信度和广泛性。

分子网络是基于串联质谱数据的组织和可视化，根据相关化合物二级质谱碎片的相似性［3］，计算光谱相似度，揭示同源质谱片段的存在［4］。根据碎片相似度的高低，运用MS-聚类算法［5］可将质谱碎片图整合为一种能够可视化的网络图谱［6］，谱图以节点形式聚集形成类似物簇［7］。在簇中，每个节点代表一种化合物，彼此之间通过直接或间接的方式进行节点连接，表示一些简单的生化反应。相连化合物可能互为转化产物，可通过将边缘的质量差异转换成结构差异，来推测识别新的化合物，进一步揭示药物和转化产物之间的作用关系［8］，辅助人们理解这些代谢物在生物过程中的生理和病理意义。目前分子网络被广泛应用于化合物的鉴定及发现、天然产物的代谢产物鉴定、天然产物化学成分的定性及定量等。该技术可与多种质谱数据处理工具连接，如代谢组学软件Progenesis QI 等，作为代谢组学数据处理的补充。

氧氟沙星是一种人工合成的氟喹诺酮类抗生素，应用较为广泛。研究表明氟喹诺酮类抗生素会导致严重或致残的副作用，这些副作用可能是不可逆的［9］。目前关于氧氟沙星体外降解产物的研究较多［10-18］，体内代谢产物的研究尚未成熟。

本文以氧氟沙星为研究对象，利用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF MS），建立特征分子网络（FBMN），并结合Progenesis QI和分子网络（GNPS）平台提供的特征分子网络快速分析氧氟沙星在小鼠肌肉、结肠、肝脏、肾脏、回肠和内容物中的代谢产物。

1 实验部分

1.1 材 料

氧氟沙星标准品（纯度99．3%，德国Dr．Ehrenstorfer公司）；二甲基亚砜、乙腈、甲醇、甲酸、甲酸铵（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 有限公司）；有机尼龙滤膜（0．22 μm，天津津腾公司）；FaVEx-NM50兽药残留净化柱（巨研科技股份有限公司）。

1.2 仪器与软件

1.2.1 仪 器ACQUITYTM超高效液相色谱仪、SYNAPT G2-Si 四极杆飞行时间质谱仪（美国Waters公司）［19-20］。GR22GⅢ高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）；N-EVAPTM112氮吹仪配备OA-SYSTM 水浴加热装置（美国Organomation 公司）；MS200 多管涡旋混匀仪（杭州瑞诚仪器有限公司）；Vortex-genie 2涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；Milli-Q Integral 5超纯水制备系统（法国默克公司）。

1.2.2 软 件数据采集软件MassLynx 4．1，数据处理软件Progenesis QI 3．0（均为Waters公司提供）；GNPS（https：//gnps．ucsd．edu）；可视化软件Cytoscape3．7．2。

1.3 实验方法

1.3.1 给药方法实验选用6周龄C57小鼠10只，随机分为两组：对照组（10%二甲基亚砜）和氧氟沙星组（50 mg/mL，10%二甲基亚砜），每组5 只小鼠。于每日上午9：30 对小鼠进行灌胃，换算小鼠的每日灌胃剂量为200 μL，每天称量小鼠体重。实验期为14 d，实验结束后取小鼠肌肉、结肠、回肠、肝脏、肾脏及内容物样本。

1.3.2 样品处理取均质后的样品0．15 g（精确至0．01 g）于50 mL 聚丙烯离心管中，先加入10 mL 0．5%（体积分数）甲酸-乙腈溶液，2 500 r/min 振荡提取30 min，10 000 r/min 离心10 min，转移全部上清液；再加入10 mL 甲醇，2 500 r/min 振荡提取30 min，10 000 r/min 离心10 min，转移全部上清液。分别准确移取两次上清液各5 mL于FaVEx-NM50快速柱，以每秒1滴流速加压，收集滤液，于40 ℃氮吹至近干，用0．1%甲酸-乙腈∶0．1%甲酸-5 mmol/L 甲酸铵（13∶87，体积比）溶液定容至1 mL，涡旋复溶，经0．22 μm有机尼龙滤膜过滤，待上机［21］。

1.3.3 色谱与质谱条件色谱条件：色谱柱为Waters Acquity BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流动相A 为含0．1%甲酸的乙腈溶液，B 为pH 3．0 的5 mmol/L 甲酸铵溶液。梯度洗脱程序：0～0．50 min，87% B；0．50～10．00 min，87%～50% B；10．00～10．75 min，50%～5% B；10．75～12．25 min，5%B；12．25～12．50 min，5%～87% B；12．50～15．00 min，87% B。流速为0．4 mL/min；柱温为40 ℃。

质谱条件：采用电喷雾（ESI）离子源正离子模式；质量数扫描范围为m/z50～1 200；源温为150 ℃，毛细管电压为3．0 kV，锥孔电压为40 V，脱溶剂气为800 L/h，脱溶剂温度为400 ℃，扫描时间：0～15 min；扫描间隔时间：0．1 s；全信息串联质谱（MSE）模式检测；分辨率模式，连续扫描数据采集，低碰撞能量为6 eV，高碰撞能量为25～45 eV。质量校正液为亮氨酸脑啡肽。

1.3.4 数据采集与处理方法采用MassLynx 进行数据采集，将采集的数据导入Progenesis QI 软件中，进行峰识别、峰对齐、基线校正、去卷积和归一化等预处理，依据人类代谢组数据库（HMDB）对代谢物进行鉴定。鉴定结果以化合物ID（包括质量数、保留时间、碎片离子谱图等信息）方式呈现。用Progenesis QI 处理数据筛选出丰度值大于3 000 的化合物，将csv 和MSP 文件登录并上传至GNPS 平台，建立FBMN。在分析计算界面，基础设置中将数据来源设置为Progenesis QI，母离子质量误差和碎片离子质量误差均设置为0．02 Da。高级分子网络设置中，最小成对余弦分数设置为0．7，碎片离子最小匹配数设置为6，单节点最大连接节点数设置为10，单个网络最大节点数设置为100。在高级谱库搜索选项中，导入speclibs 文件，库中搜索最小匹配峰数设置为6，得分阈值设置为0．7。多变量统计选项中，距离度量设置为cosine，在此基础上进行分析，所得结果导入Cytoscape 软件，将分析计算结果可视化为分子网络图。

2 结果与讨论

2.1 Progenesis QI鉴定结果

样品的总离子流色谱图如图1所示。利用Progenesis QI结合HMDB库对所有小鼠组织样本数据进行鉴定，共筛选出54 种小鼠体内可能的代谢物，信息包括代谢化合物的名称、质荷比、保留时间、P值、偏差（ppm）。由显著性检验得到P值，判断化合物间的差异，结果均小于0．05，表示鉴定结果为碰巧出现的可能性小于5%，具有显著意义。在鉴定的54种化合物中，大部分为内源性代谢物，共有2个与氧氟沙星代谢直接相关的化合物，即培氟沙星、N-氧化产物。其保留时间、加合离子以及母离子、子离子质量数的理论值和实际值偏差如表1所示，偏差均小于5 ppm。

表1 基于Progenesis QI软件的氧氟沙星及代谢产物鉴定结果Table 1 The identified results of ofloxacin and its metabolites based on Progenesis QI software

图1 代表性样品的总离子流色谱图Fig．1 Total ion chromatograms of representative samples

2.2 使用GNPS平台绘制的特征分子网络

在生成的FBMN 中，喹诺酮类成分可以被聚集，且质谱裂解存在一定的规律，所形成的特征分子网络可视化图如图2所示。在GNPS库中进行代谢物匹配，通过化合物二级质谱相似性原理，匹配到化合物氧氟沙星，分子式为C18H20FN3O4，加合离子为［M+H］+，中性离子质量为361．14 Da，质荷比为362．150 6，匹配度为0．941 496。

图2 小鼠体内氧氟沙星及代谢产物的分子网络图Fig．2 Molecular network diagram of ofloxacin and its metabolites in mice

图2 为氧氟沙星（m/z362．150 6［M+H］+，化学式C18H20FN3O4，保留时间2．48 min）分子集群，该集群包括16 个化合物节点，其中与氧氟沙星直接相连的有9个节点，经鉴定有5个化合物与氧氟沙星直接相关，推测的代谢化合物信息如表2所示。m/z334．156 2［M+H］+（保留时间为2．37 min）的节点，分子量与氧氟沙星相差CO 的精确质量数，是氧氟沙星开环氧化形成分子式为C17H20FN3O3的代谢产物；m/z378．145 5［M+H］+（保留时间为2．40 min）的节点，分子量与氧氟沙星相差1 个O 的精确质量数，是氧氟沙星的羟基化或某个N 上发生氧化，分子式为C18H20FN3O5的代谢产物，这两个化合物与上述Progenesis QI 方法中鉴定出培氟沙星、N-氧化产物的结果一致。m/z318．160 9［M+H］+（保留时间为2．49 min）的节点，分子量与氧氟沙星相差CO2的精确质量数，是氧氟沙星发生了脱羧反应，形成分子式为C17H20FN3O2的代谢产物。m/z261．102 5［M+H］+（保留时间为2．50 min）的节点与m/z318．160 9［M+H］+的节点相差C3H7N 的精确质量数，是脱羧、N-脱烷基化后，分子式为C14H13FN2O2的代谢产物。m/z183．090 8［M+H］+（保留时间为2．71 min）的节点，推断为脱氨基并开环脱羧后，分子式为C9H11FN2O 的代谢产物。根据小鼠体内代谢产物和分子网络中的连接关系，推断小鼠体内氧氟沙星可能的断裂途径如图3所示。

表2 特征分子网络推测氧氟沙星及代谢产物的结果Table 2 The results of ofloxacin and its metabolites speculated by FBMN

图3 特征分子网络分析推断小鼠体内氧氟沙星可能的断裂途径Fig．3 Possible rupture pathways of ofloxacin in mice inferred by FBMN analysis

在代谢产物分析中，依据化合物的响应值，在各组织样本中均检出大量氧氟沙星原药残留，肝脏和回肠样本中氧氟沙星原型累积最多，其次是肾脏、内容物和肌肉样本，在结肠样本中含量最少。如图4 所示，代谢产物以脱羧产物为主，在各组织样本中的响应值较高，在肝脏和回肠样本中的含量最高，肾脏、肌肉和内容物样本中较高，结肠样本中的含量较少；脱羧后N-脱烷基化产物在肝脏和回肠样本中的含量最高，在肾脏、肌肉和内容物样本中较高，结肠样本中的含量较少；N-氧化产物在肝脏样本中的含量最高，在回肠、结肠和肌肉样本中的含量较少；脱氨后开环脱羧产物在肝脏样本中的含量最高，肾脏其次，在肌肉和内容物样本中较少；培氟沙星在肝脏样本中的含量最高，内容物样本中其次，其他样本中较少。综上，肝脏是氧氟沙星的主要代谢场所，其代谢产物以脱羧产物为主。

图4 氧氟沙星及代谢产物在不同样本中的相对含量Fig．4 The relative contents of ofloxacin and its metabolites in different samples

3 结 论

本研究借助UHPLC-Q-TOF MS，使用Progenesis QI 进行数据预处理和鉴定，并首次使用GNPS 平台的FBMN工具，建立特征分子网络探究氧氟沙星在小鼠体内的代谢产物，得到小鼠体内氧氟沙星的5种代谢产物，分别为脱羧产物、培氟沙星、N-氧化产物、脱羧后N-脱烷基化产物、脱氨后开环脱羧产物，并得到小鼠体内氧氟沙星可能的断裂途径，发现肝脏为氧氟沙星主要的代谢场所。