张 严，朴林华，佟嘉程，马炫霖，刘珺宇

（北京信息科技大学 北京传感器重点实验室，北京 100101）

微流控芯片是指通过微加工技术将微驱动泵、微储液池、微流体管路、微开关、微检测元器件和连接器等功能元件高度集成在微芯片材料上的微全分析系统［1］。其可以替代传统的大型检测仪器，缩短检测时间以及减少试剂用量［2］。微流控芯片的基底材料包括硅、玻璃和聚合物。硅材料因具有优良的化学惰性和热稳定性而最早被研究人员用于制备微流控芯片的基底材料，但其由于易碎、透光性差、价格昂贵、表面化学改性困难而逐渐被玻璃所取代［3］。玻璃廉价易得，具有优良的光学性能和电渗特性，但其加工制备较复杂，需使用具有一定危险性的化学品进行刻蚀［4］。聚合物价格低廉，具有良好的透光性和电绝缘性，易改性且适合细胞培养和规模化生产，但其存在与大多数有机溶剂不相容、成本高等问题［5］。纸基微流控芯片是以滤纸代替硅、玻璃和聚合物等基底材料，采用光刻、蜡印、喷墨打印等技术制备成具有亲疏水交替结构的微流控芯片［6］。相对于其他材料制备的微流控芯片，纸基微流控芯片具有成本低、制备简单、尺寸小、便于携带、分析速度快、生物兼容性好、样品试剂消耗少、无需额外的流体驱动装置、环境可降解、可实现多目标物同时检测，以及可集成多种检测方式等优点［7-8］。基于纸芯片的诸多优势，可将其广泛应用于医学诊断、环境检测和食品安全等领域。

纸基微流控芯片的制备原理是通过物理或者化学手段填充纤维纸的空隙或者对纤维素进行改性从而图案化纸基材料，在纸基材上构建允许流体定向流动的亲疏水通道。常见的制备方法包括光刻法［9］、蜡印法［10］、喷墨打印法［11］、激光打印法［12］、等离子体处理法［13］等。其中光刻法相对于其他几种方法具有较高的加工精度，且最小通道宽度可达微米级别，可广泛用于微小尺寸和高精度的纸芯片制备。2007 年Whitesides 课题组［14］首次提出了使用光刻法制备纸芯片，并将其成功用于葡萄糖和蛋白质的检测。此后，王方方等［15］利用光刻法制备了纸芯片并将其用于葡萄糖和尿酸的检测研究，Kamali 等［9］成功利用光刻法制备纸基微流控芯片，并探究了不同工艺参数对通道质量的影响，实现最小100 μm的通道宽度。但以上研究的光刻技术在制备纸芯片时需提前定制特定的掩膜版，整个工艺流程复杂、耗时、成本高昂，且每一次更改纸芯片结构均需重新制作掩膜，欠缺灵活性。

本文提出了无掩膜光刻法制备纸基微流控芯片，首先使用L-edit 软件设计纸芯片的版图结构，并通过光刻工艺将设计的版图结构转移到滤纸上，考察了不同曝光时间对纸芯片微通道亲疏水性能的影响，通过接触角测量实验探究疏水图案的疏水程度，并利用无掩膜光刻技术制备的纸芯片进行亚硝酸盐的检测研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Whatman No．1 滤纸（美国丹纳赫集团），硅片（宁波江北赛邦晶圆电子材料经营部），胶棒（Jong le Nara Co．，Ltd．），RFJ-220瑞红光刻胶、RFX-2277负胶显影液（瑞红电子化学品股份有限公司），KW-4B型台式匀胶机、SC-H-II型烤胶机（北京赛德凯斯电子有限责任公司），计时器（广州星威电子实业有限公司），无掩膜光刻机（中国科学院光电技术研究所），超声清洗机（深圳市春霖清洗设备有限公司），移液枪（上海力辰邦西仪器科技有限公司），亚硝酸盐标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心），磺胺（天津大茂化学试剂厂），盐酸萘乙二胺（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），电子天平（上海菁海仪器有限公司），药匙（泰州市培正科教仪器有限公司），棕色容量瓶（江苏华鸥玻璃有限公司）。

1.2 纸基微流控芯片的制备

纸芯片的制备基于RFJ-220 瑞红负性光刻胶，负性光刻胶在前烘时会蒸发掉部分溶剂提高光引发剂的含量，在曝光时负性光刻胶受到光照发生交联反应形成致密的交联网络，而未曝光的区域则会在显影时被显影液除去从而恢复纸的亲水性，形成具有亲疏水区分的纸芯片，随后使用紫外接触角测量仪对疏水区域的接触角进行测量，并使用显微镜对制造的纸芯片进行显微观测。纸芯片的制备工艺流程如下：

①使用L-edit 软件绘制纸基微流控芯片结构的数字掩膜；将滤纸剪裁成4 寸硅片大小并平整粘贴于硅片表面；

②将芯片放入匀胶机，设定转速为慢速50 r/s，高速750 r/s，进行匀胶；

③将匀胶后的芯片放在热台上，105 ℃烘烤60 s，部分蒸发光刻胶中的溶剂；

④将烘烤后的芯片取下，冷却后放入光刻机工作台上，并设定曝光时间5 s，胶面设置95．8；

⑤将正面曝光后的芯片揭下翻转粘贴在硅片表面，放入光刻机中再次进行反面曝光；

⑥将曝光完成的芯片取出放入培养皿中，倒入显影液充分去除未参与曝光部分纸表面的光刻胶，从而恢复纸的亲水性；

⑦将显影后的纸芯片用水冲洗并放在热台上105 ℃烘烤3 min。

1.3 纸基微流控芯片检测亚硝酸盐

首先配制亚硝酸盐标准浓度梯度液和检测试剂Griess试剂。将100 μg/mL亚硝酸盐标准样液加水进行稀释得到质量浓度分别为0、1、3、5、10、15、20 μg/mL 的亚硝酸盐标准梯度液。Griess 试剂由磺胺溶液（A 液）和盐酸萘乙二胺溶液（B 液）按1∶1 混合组成。A 液：称取0．5 g 磺胺充分搅拌使其溶解并定容于50 mL 棕色容量瓶中储存备用。B 液：称取0．5 g 盐酸萘乙二胺加入适量水，搅拌使其充分溶解后定容于50 mL 棕色容量瓶中避光存储。使用移液器将0．5 μL 的B 液滴加在纸芯片的检测区，真空干燥5 min；然后在纸芯片的进样区滴加6．5 μL 亚硝酸盐溶液，待亚硝酸盐溶液通过纸芯片通道流至检测区时，在检测区滴加0．5 μL 的A 液。磺胺在酸性环境下与亚硝酸盐发生重氮反应，生成瞬态重氮盐，之后与预先干燥沉积的盐酸萘乙二胺反应生成紫红色络合物，故在检测区可观察到颜色紫红色的变化，即可证明亚硝酸盐的存在。在滴加A液后等待5 min，然后将纸芯片置于暗箱中以闪光灯作为光源使用手机进行拍照，将反应产生的颜色图像上传至计算机，使用Photoshop软件进行处理得到不同浓度亚硝酸盐溶液产生颜色变化后对应的灰度值，从而建立亚硝酸盐浓度与其颜色灰度值的对应关系。

1.4 紫外可见分光光度法检测亚硝酸盐

分别将各质量浓度梯度的50 μL 亚硝酸盐溶液与3 mL Griess 试剂加至比色皿中进行混合，将3 mL水加至比色皿中作为参比溶液。设定紫外可见分光光度计的扫描波长为200～700 nm，得到各浓度对应的扫描曲线，取扫描245 nm 处对应的吸光度值与亚硝酸盐浓度建立对应关系，验证纸芯片检测法与分光光度法的一致性。上述方法均在同一实验室环境下进行。

2 结果与讨论

2.1 纸芯片的制造

采用无掩模光刻法制备的纸基微流控芯片如图1A所示，纸芯片由进样区（边长4 mm）、流道（长度4 mm）和比色检测区（边长3 mm）组成，整个纸芯片的样本容量约10 μL。从图中可以看出纸芯片的边界和通道结构清晰，疏水壁垒呈现深黄色，其他区域为白色。采用紫外接触角测量仪对疏水壁垒进行测量得到疏水区域的接触角为100．62°（如图1B），表明采用无掩模光刻法制备的纸芯片疏水区域具有非常好的疏水性。深黄色的疏水壁垒是由于负性光刻胶在光刻机中受到曝光发生交联反应形成的交联网络，而白色的亲水区域则是未参与反应的光刻胶在显影时被显影液去除从而恢复白色的纸纤维。将芯片置于显微镜下进行观测（如图1C），纸在恢复亲水性时仍残留部分光刻胶无法去除干净，纸纤维呈淡黄色，因此液体在其上的流动速度下降，但下降程度在可接受范围内，不影响纸芯片的使用。同时可以看到曝光后形成的交联网络非常致密紧实，形成了较强的疏水屏障。

图1 纸基微流控芯片（A），疏水壁垒的接触角（B）及光刻后滤纸的显微观测图（C）Fig．1 Paper-based microfluidic chip（A），contact angle of hydrophobic barriers（B），and microscopic observation of filter paper after photolithography（C）

2.2 制备条件的优化

采用相同的制备工艺，在同一张纸基底上分别采用1 、2 、3 s的曝光时间对芯片进行正反面曝光，并在光刻后的纸芯片亲水区域内分别滴加10 μL 墨水进行测试，探究不同曝光时间对疏水屏障疏水强度的影响（见图2）。结果显示，在进样区滴加墨水后，1 s 曝光时间产生的疏水图案处液体发生渗漏，疏水屏障未起到良好的疏水作用。2 s 和3 s 曝光时间产生的图案则具有良好的疏水作用，可阻挡液体流出屏障并沿既定的图案流至整个区域，且芯片蔬水区域的接触可达100．56°。实验结果表明曝光时间过短会导致交联反应不充分，无法充分形成阻挡液体流动的交联网络，过长则会导致交联反应过重，从而对图案边缘产生影响，不利于显影时恢复纸的亲水性，也延长了制备时间。实验最终选择最佳曝光时间为2 s。

图2 曝光后墨水流动测试图Fig．2 Ink flow test chart after exposure

2.3 纸芯片特征尺寸研究

纸基微流控芯片通常需要纸芯片具有更小的芯片结构以减少检测试剂的量，同时减小芯片的尺寸以集成更多的芯片。本文采用无掩膜光刻法制作纸芯片，设计通道宽度分别为90 μm 和100 μm，采用“1．2”的制作工艺进行无掩膜光刻，烘干后使用显微镜观察和测量芯片的通道宽度，并分别在每个芯片的进样区滴加10 μL 黑色墨水（见图3）。结果显示，墨水在100 μm 的通道中可以很好的流动，但在90 μm 的通道中流动受阻。采用显微镜对100 μm通道进行测量，得到纸芯片最小亲水通道的实际宽度为（68±5） μm。

图3 不同通道宽度的纸芯片液体流动情况Fig．3 Liquid flow of paper chips with different channel widths

为获得更小的芯片尺寸，不仅要尽量减小亲水通道的宽度，疏水屏障的宽度同样具有重要影响。采用相同的芯片结构分别设计宽度为70、80、90 μm 的疏水屏障，采用“1．2”的纸芯片制作工艺，并在亲水区域滴加5 μL黑色墨水，液体的流动情况如图4所示。70 μm宽的疏水屏障未能阻挡液体的流动，而80 μm和90 μm宽的疏水屏障具有阻挡液体流动的效果。使用显微镜对加工后的实际芯片疏水屏障进行测量，结果显示采用无掩模光刻法制作的纸芯片的最小疏水屏障宽度为（104±9）μm。

图4 液体在不同宽度疏水屏障中的流动情况Fig．4 Flow of liquids in hydrophobic barriers of different widths

实验显示，显影干燥后，纸芯片的实际亲水通道宽度小于设计宽度，疏水屏障宽度大于设计宽度。这可能是因为曝光后的疏水屏障和未曝光区域在显影液和水中具有不同的变形量，所以导致干燥后纸芯片的疏水屏障变大，而亲水通道变小。

2.4 亚硝酸盐的测定

采用纸芯片法进行亚硝酸盐检测，结果如图5 所示。从图中可以看出亚硝酸盐和检测试剂反应后发生颜色变化，且随着亚硝酸盐浓度的增大颜色由浅粉色变成紫红色。使用Photoshop 软件对手机拍摄的显色结果进行分析，得到不同浓度（1、3、5、10、15、20 μg/mL）亚硝酸盐溶液及其对应的灰度值。结果显示，在1～20 μg/mL范围内二者具有良好的线性关系，线性方程为Y=3．450X+34．83，r2=0．977 0。采用相同的纸芯片和实验方法重复检测10 μg/mL亚硝酸盐溶液3次，显色后的颜色强度平均值为73．6，标准误差为0．98。

图5 纸芯片法检测亚硝酸盐的显色结果及线性曲线Fig．5 Color development results and linear curve of nitrite detection by paper chip method

紫外可见分光光度计检测亚硝酸盐浓度是一种被广泛认可的方法（如图6A），从图中可以观察到不同质量浓度亚硝酸盐溶液在245 nm 和540 nm 处有明显吸收峰，且以245 nm 处的吸光度最大。将亚硝酸盐溶液质量浓度（1、3、5、10、15、20、25 μg/mL）与其在245 nm 的吸光度建立对应关系，结果显示在1～25 μg/mL范围内二者具有良好的线性关系（图6B），线性方程为Y=0．011 56X+3．180，r2=0．992 3。方法用于亚硝酸盐的检测，检测结果与纸芯片法 具有良好的一致性。

图6 不同质量浓度亚硝酸盐在200～700 nm波长下的扫描曲线（A）及不同质量浓度亚硝酸盐在245 nm处的吸光度（B）Fig．6 Scan curves of nitrite different concentrations at 200-700 nm（A） and absorbance values of nitrite with different concentrations at 245 nm（B）

3 结 论

本文提出了一种基于无掩膜技术的新制备方法，采用该方法制备的纸芯片具有明显的亲疏水区分，无需制作特制的掩膜版，仅需2 s 的曝光时间就可以形成较强的疏水屏障，疏水区域的接触角达100．56°。该方法制备的纸芯片最小可实现的疏水屏障宽度为（104±9） μm，最小可实现的亲水通道宽度为（68±5） μm，将纸芯片用于亚硝酸盐的检测，得到亚硝酸盐和显色图像灰度值之间具有良好的线性关系，线性方程为Y=3．450X+34．83，r2=0．977 0，检测结果与分光光度计法具有良好一致性。该方法具有加工精度高、制造简便、工艺流程简单、时间短及便于携带等优点，制备的纸芯片还可用于基于显色反应的多种物质检测，具有广泛的应用范围和良好的使用前景。