周思聪

（福建中医药大学附属第二人民医院甲状腺血管疝外科，福建 福州 350001）

甲状腺癌是临床最常见的内分泌恶性肿瘤之一，约占全部恶性肿瘤的1%。根据我国2022年卫生组织公布数据：甲状腺癌的发病率以每年约4%的速度上升，已成为全球发病率增长最快的恶性肿瘤。对于甲状腺乳头状癌，如薛立斋所云：“坚硬不可移曰石瘿”早期查体时发现甲状腺结节质硬，不能随吞咽上下移动，推之不动，与周围边界不清。纠其病机，亦责之于气、痰、瘀结聚。痰凝、血瘀、气滞日久结于颈前，日久蕴毒乃发石瘿之病。故推测甲状腺乳头状癌的发病与气、血、水运行失常相关，病灶位之肝、脾[1]。根据本病的主要临床表现[2]，中医将其类属于瘿瘤范畴。活血消瘿方是陈如泉教授临床治疗甲状腺肿的经验方[3]，已有临床研究显示[4-5]，活血消瘿方治疗结节性甲状腺肿作用优于优甲乐，具有肯定的临床疗效及安全性。

1 实验材料与方法

1.1 药品及试剂

1.1.1 实验动物 BALB/C裸鼠（SPF级）60只，雌性；体质量（18±2）g。

1.1.2 试剂与仪器 主要试剂与试剂盒：RPMI 1640基本培养基（美国Gibco公司）、DMSO（德国Wcker Chemie公司）、碘125I甲状腺球蛋白试放射免疫分析药盒。主要仪器：震荡器（公司：常州国华，型号：SHA-B）、CO2培养箱（公司：美国Revco，型号：300/3000）、高压蒸汽灭菌锅（公司：美国Zealway，型号：GI54DWS）、电冰箱（-24～8 ℃）公司：青岛海尔，型号：BCD）、γ-放射免疫计数器（公司：西安二六二厂，型号：FJ-2021）、电热恒温水箱（公司：天津泰斯特，型号：600型）[6]。

1.1.3 动物 在相对无菌的通风清洁SPF级环境中，饲喂的6～8周龄的成年免疫缺陷鼠将成为最佳人肿瘤细胞接种鼠。根据实验目进行皮下接种肿瘤细胞株进行造模。分组与处理：将造模完成的免疫缺陷小鼠进行筛选，剔除肿瘤过大或过小的甲状腺癌小鼠，将筛选完的小鼠随机平均分为4个组，分别为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，对低剂量组、中剂量组、高剂量组进行灌胃化裁消瘿方溶液，其中相对应的喂养成人用量的5倍、10倍、20倍计算，分别对小鼠进行灌胃治疗，每次灌胃量为0.4 mL，对照组予等体积无菌蒸馏水0.4 mL，连续灌胃14 d[7]。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 主要分为3个小组：将化裁消瘿方（方药组成：夏枯草12 g、柴胡9 g、半夏9 g、莪术9 g、郁金6g、白术9 g、茯苓12 g、甘草6 g）依据用量不同分3组。其中主要以6 g/kg（低剂量组）、12 g/kg（中剂量组）、24 g/kg（高剂量组），分别对小鼠进行灌胃治疗[8]。

1.2.2 细胞培养

1.2.2.1 甲状腺乳头状癌细胞的复苏 ①从液氮罐里将细胞株取出，冻存管中的2/3放进37 ℃水浴锅中，通过最大速度振荡，令其迅速在2 min内融化[9]。②经酒精消毒过双手后，将酒精灯点燃，拿酒精棉球擦拭培养基的瓶口，分别用酒精灯对瓶口和瓶盖消毒，将它们分别放在酒精灯两侧。③将15 mL离心管用封口膜封口，放置离心机中，并且将离心管配平。1 000 r离心5 min。④将装有细胞株的离心管拿出，在培养瓶的瓶身处做上实验标记，用手指轻轻晃动使细胞分散均匀。

1.2.2.2 培养液的更换 ①首先将瓶子通过紫外线消毒大概30 min，之后放在超净工作台上，然后双手进行消毒。②把瓶身保持干净，然后再采用酒精对瓶口进行擦拭，同时瓶盖也是需要进行消毒，具体消毒时间一般再反复打开瓶盖5～6次以后再进行消毒。③瓶口在酒精灯上消毒2～3次。④拿出 1个5 mL的巴氏滴管，吸管进行悬空，吸取内部培养液体。然后悬空移入到培养皿中。在此过程中在把实验试剂和相关超工作台器材进行取出[10]。⑤培养瓶放置再37 ℃，5%二氧化碳培养液中，然后不断地进行观测，看自身在2～9 h后，纤维细胞生长情况。

1.2.2.3 细胞株的保存 ①消毒大概30 min以后，需要开启全新超干净工作台[11]。②操作核心就是培养皿和操作台的干净，在此过程中需要将酒精的棉化不断的进行放在的培养的瓶口进行慢慢的擦拭。③将培养皿中胰岛素导入器皿中，在此过程中需要5 min，等细胞之间具有空洞以及各种缝隙在找合适机会进行填充。④吸取在此过程中，主要的在此基础上2 mL主要培养的各种的在此基础上在此过程中在反复的冲洗的过程中需要各种的15～20次，在此基础上需要不断进行封口以及在此基础上需要的做的则是在离心机的平均的转速位1 000 r离心5 min[12]。⑤需要在此将离心管中的一些废弃倒入到缸中，在加入离心管需要加入2 mL完全培养，在用3 mL巴氏滴管轻柔吹吸30次左右使细胞分散均匀。

1.2.2.4 动物模型的制备 60只5周龄左右，所有的小白鼠的都是在实验一周，这样传到0.25%胰酶消化离心，在放入到没有血清的培养皿中其中对于该浓度为1×106个/0.1 mL，在此细胞的悬浮液，必须的操作者是无菌的进行而且必须的戴口罩，手部也是进行全方面的消消毒。每日用游标卡尺测量记录每只小裸鼠肿瘤的长径与宽径，每次测量两遍。接种后12 d，接种人甲状腺癌裸鼠移植瘤动物随机分为4组，分别予等体积的无菌蒸馏水、低剂量化裁消瘿方溶液、中剂量化裁消瘿方溶液、高剂量化裁消瘿方溶液0.4 mL进行灌胃治疗，每日1次，连续灌 胃14 d。

1.2.3 取材和指标检测 对实验8周以后的老鼠，在进行双甲状腺，主要在于保存，采用相关仪器给监测，结果以A-lphaEase FC软件取值，大鼠甲状腺细胞凋亡水平；PCNA计算指标的测定与标本的采集分别于模型制备完成后d1、d2、d4、d8、d12、d14定期测量裸鼠抑瘤率。灌胃治疗结束后第1天，即接种后27 d将各组裸鼠以颈椎脱臼法处死，取出瘤体组织。

1.3 统计学方法 统计学方法采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计量数据采用均数±标准差（±s）进行描述。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠甲状腺组织中PCNA的表达 对照组平均灰度值为（5 673±444），低剂量组平均灰度值为（6 236±567），中剂量组平均灰度值为（9 065± 721），高剂量组平均灰度值为（8 097±456）。由此可见，低、中、高剂量活血消瘿方均可降低模型大鼠甲状腺细胞PCNA的表达。见表1。

表1 PCNA在大鼠甲状腺细胞中表达（±s）

表1 PCNA在大鼠甲状腺细胞中表达（±s）

2.2 各组大鼠甲状腺细胞凋亡水平 对照组平均灰度值为（40.76±2.24），低剂量组平均灰度值为（22.67±5.18），中剂量组平均灰度值为（22.46± 6.99），高剂量组平均灰度值为（17.15±4.59）。由此可见，低、中、高剂量活血消瘿方均可促进大鼠甲状腺细胞纤维抑制亡，并且小剂量活血消瘿方作用最为显著。见表2。

表2 各组大鼠甲状腺凋亡细胞比例（±s）

表2 各组大鼠甲状腺凋亡细胞比例（±s）

3 讨论

化裁消瘿方组成：夏枯草12 g、柴胡9 g、半夏9 g、莪术9 g、郁金6 g、白术9 g、茯苓12 g、甘草6 g进行治疗，目前己发现有多种评价细胞增殖的方法，其中PCNA是最常用的指标之一[13]。在细胞核内存在可溶性与不溶性2种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，不溶性PCNA较稳定，一般作为评价细胞增殖状态的一个指标。

结节性甲状腺肿的发病机制尚不清楚[14]，目前认为可能与甲状腺细胞的增殖和凋亡失去平衡有关[15]。PCNA是目前己发现的最常用的评价细胞增殖的方法。在实验性大鼠甲状腺肿模型中，PCNA较正常对照组相比，表达明显增强，在去掉致甲状腺肿因素后，随着甲状腺重量的减轻，PCNA的表达也逐渐减弱，此结果与本实验相符。