王志超 杨广达 朱蔼瑜 陈倩雅

（广州医科大学附属第四医院，广东 广州 511300）

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，转移是导致患者死亡的主要原因。虽然结直肠癌治疗取得了进展，但转移性结直肠癌的治疗仍具有挑战性。本研究旨在探索miR-645是否通过靶向调控STING来影响结直肠癌的转移，并进一步阐明其作用机制。使用细胞实验和动物模型来研究miR-645在结直肠癌中的功能，并通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）、Western blot、免疫荧光染色等技术来评估miR-645和STING的表达水平以及结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力。通过这项研究，希望进一步了解miR-645和STING在结直肠癌转移中的相互关系，并为开发新的靶向miR-645和STING的治疗策略提供理论基础。这将为结直肠癌患者的个体化治疗和预后改善提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 结直肠癌细胞系和组织样本的获取和处理 结直肠癌细胞系和组织样本的获取和处理是研究miR-645靶向STING调控结直肠癌转移作用机制的重要步骤。

1.1.1 结直肠癌细胞系的选择与培养 结直肠癌细胞系的选择对于研究具有转移能力的细胞行为至关重要。通常选择具有不同转移能力的结直肠癌细胞系作为研究对象，如具有高度转移能力的转移性结直肠癌细胞系和较低转移能力的非转移性结直肠癌细胞系。这样可以比较它们在miR-645调控下的表型差异。

结直肠癌细胞系的来源和鉴定是确保实验可靠性和重复性的重要步骤。细胞系的来源可以是临床样本、细胞库或其他研究实验室。在选择细胞系时，需要对其进行鉴定，确认其为结直肠癌细胞，并排除其他细胞类型的污染。结直肠癌细胞系的培养条件和培养基的配制需要根据细胞系的特性进行优化。常用的培养基包括DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）和RPMI-1640（roswell park memorial institute 1640），其中添加适当浓度的胎牛血清、抗生素和其他所需添加物。细胞应在37°C恒温培养箱中、5% CO2的湿度条件下培养。

结直肠癌组织样本的获取是进行临床相关研究的关键环节。结直肠癌组织样本可以通过手术切除、活检或穿刺等方法获取。在收集样本时，需要遵循伦理审查委员会的相关规定和患者知情同意。收集到的组织样本应尽快进行处理或储存，以确保其质量和可靠性。

1.1.2 处理结直肠癌细胞系和组织样本 处理结直肠癌细胞系和组织样本包括细胞的培养、传代和冻存，以及组织样本的固定、切片和染色等操作。细胞的培养需要定期检查细胞的健康状况，包括细胞形态、增殖速度和细胞存活率。传代细胞是为了维持细胞系的稳定生长和扩增。细胞的冻存可用于长期保存和后续实验。对于结直肠癌组织样本，需要进行固定处理。常用的固定剂包括10%缓冲福尔马林（formaldehyde）溶液，该溶液可固定组织细胞的形态和结构。固定后，组织样本可以进行切片制备。切片可以使用切片机将组织切割成薄片，通常为 5～10 μm厚度。切片后，可以进行染色处理，如常用的组织学染色方法包括血液学染色（如血液片染色）、免疫组织化学染色和核酸染色（如HE染色和DAPI染色）等。这些染色方法可用于观察组织细胞的形态特征、蛋白质表达以及核酸的定位和含量[1]。

结直肠癌细胞系和组织样本的获取和处理是研究miR-645靶向STING调控结直肠癌转移作用机制的关键步骤。通过获取适当的细胞系和组织样本，并进行相应的处理和处理，可以为后续的实验和分析提供可靠的材料基础。这将有助于深入理解miR-645和STING在结直肠癌转移中的作用机制，并为进一步研究提供有力的支持。

1.2 miR-645和STING的表达检测 miR-645和STING的表达检测是研究miR-645靶向STING调控结直肠癌转移作用机制的关键步骤。下面阐述了相应的方法和技术。

1.2.1 miR-645的表达检测 ①RNA提取：使用商业化的RNA提取试剂盒从结直肠癌细胞系或组织样本中提取总RNA，包括小RNA分数。②miRNA逆转录：使用miRNA逆转录试剂盒将提取得到的小RNA逆转录为cDNA，其中包括miR-645。③实时定量聚合酶链反应（qPCR）：使用miR-645特异性引物和探针进行qPCR，测定miR-645的表达水平。常规化对内参（如U6 snRNA）的表达量，计算miR-645的相对表达量。

1.2.2 STING的表达检测 ①蛋白提取：使用细胞裂解缓冲液或蛋白提取试剂盒从结直肠癌细胞系或组织样本中提取总蛋白。②Western blot：将提取的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移到聚丙烯酰胺膜上。使用特异性的STING抗体进行免疫印迹分析，检测STING的蛋白表达水平。常规化对内参（如β-actin）的表达量，计算STING的相对表达量。

1.3 miR-645过表达和沉默技术的建立

1.3.1 miR-645过表达技术 ①构建miR-645过表达载体：将miR-645的序列克隆到合适的miRNA过表达载体中，如pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。②转染结直肠癌细胞系：使用合适的转染试剂将miR-645过表达载体转染到结直肠癌细胞系中，如使用Lipofectamine 3000进行转染。③筛选和确认过表达细胞系：使用适当的筛选剂，如puromycin，筛选并扩增miR-645过表达细胞系。使用qPCR验证miR-645的过表达水平。

1.3.2 miR-645沉默技术 ①miR-645抑制剂转染：使用miR-645特异性的抑制剂（anti-miR-645）将其转染到结直肠癌细胞系中，如使用Lipofectamine 3000进行转染。②筛选和确认沉默细胞系：根据抑制剂的特性，选择合适的时间点进行沉默效果的评估。使用qPCR检测miR-645的表达水平来确认miR-645的沉默效果。

2 结果

2.1 miR-645在结直肠癌组织中的高表达 使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）方法对结直肠癌组织样本进行miR-645的表达检测。qRT-PCR分析显示，miR-645的表达水平在结直肠癌组织中明显升高，与对照组织相比具有统计学上的显著差异（P＜0.05）。进一步的分析显示，miR-645的高表达与结直肠癌的临床病理特征相关。与低表达组相比，miR-645高表达组在肿瘤大小、淋巴结转移和分期等方面呈现出更严重的病理特征。这提示miR-645的高表达可能与结直肠癌的侵袭和转移能力增强相关。此外，通过生存分析，观察到miR-645的高表达与结直肠癌患者的不良预后相关。高miR-645表达组的患者生存期明显缩短，表明miR-645的高表达可能作为结直肠癌预后的不良预测指标。

综上所述，研究结果显示miR-645在结直肠癌组织中高度表达，并与结直肠癌的临床病理特征和患者预后密切相关。这表明miR-645在结直肠癌的发生和发展中可能具有重要的调控作用。进一步的机制研究将有助于揭示miR-645在结直肠癌中的功能机制，并为miR-645作为潜在的治疗靶点提供理论基础。见图1。

图1 结直肠癌肿瘤组织（CRC）和癌旁组织（NAT）中miR-645的检测结果

2.2 生物信息学方法 我们使用生物信息学方法对miR-645的潜在靶向基因进行预测，并发现STING基因是miR-645的潜在靶向靶点之一。通过使用多个公开可用的miRNA靶向预测算法和数据库，我们对miR-645与STING基因之间的相互作用进行了分析。这些算法和数据库包括miRanda、TargetScan、miRBase和miRTarBase等。综合这些预测结果，我们发现STING基因在其3'非翻译区（3' UTR）具有与miR-645互补的结合位点序列。

进一步的分析显示，miR-645与STING基因的结合位点具有高度的保守性，这表明miR-645可能通过与STING基因的结合来调控其表达水平。通过生物信息学分析，还发现miR-645与STING基因在功能途径和信号通路上存在潜在的关联。STING作为一个重要的免疫调节分子，参与调节细胞的免疫应答和抗病毒防御。miR-645可能通过靶向STING基因的调控，影响结直肠癌细胞的免疫逃逸和转移能力。故而，生物信息学分析预测miR-645 可能通过靶向STING基因参与结直肠癌的转移调控。这一发现为深入研究miR-645和STING之间的相互作用及其在结直肠癌转移中的作用机制提供了初步的线索。进一步的实验研究将有助于验证miR-645与STING基因之间的相互作用，并揭示其在结直肠癌转移中的具体调控机制。miR-645与STING 3'UTR结合示意图见图2。

图2 miR-645与STING 3'UTR结合示意图

2.3 荧光素酶活性检测 我们将STING的3'UTR构建到荧光素酶报告基因下游，然后过表达或干扰miR-645后检测荧光素酶活性。结果显示，过表达miR-645能够降低荧光强度，干扰miR-645能够上调荧光强度。这表明miR-645能够通过结合STING的3'UTR对其进行负调控。见图3。

图3 荧光素酶报告实验结果

3 讨论

3.1 miR-645靶向STING调控结直肠癌转移的机制 miR-645作为一种重要的微小RNA分子，已被发现在多种肿瘤中表达异常，并与肿瘤的发生、发展和转移相关。在本研究中，发现miR-645在结直肠癌组织中高表达，并通过生物信息学预测发现miR-645可能通过靶向STING基因参与结直肠癌的转移调控。STING作为一种免疫调节分子，在细胞的免疫应答和抗病毒防御中发挥重要作用。过去的研究已经表明STING在抑制肿瘤的发生和转移中具有重要功能。然而，miR-645通过靶向STING基因的调控可能导致STING的表达下调，从而影响免疫逃逸和转移能力，促进结直肠癌的发展[2]。

在本研究中，通过实验证实了miR-645在结直肠癌细胞系中的高表达与STING的蛋白表达水平的逆相关关系。miR-645的过表达导致STING的表达下调，而miR-645的沉默则使STING的表达上调。进一步的功能实验结果表明，miR-645的过表达促进了结直肠癌细胞系的转移能力，而miR-645的沉默则抑制了细胞的转移能力。这些结果提示miR-645通过靶向STING基因调控结直肠癌的转移过程。miR-645的高表达可能导致STING的下调，从而减弱了免疫应答和抗肿瘤能力，促进了结直肠癌细胞的转移。相反，miR-645的沉默可能通过增强STING的表达，提高免疫逃逸和抑制转移能力，抑制结直肠癌的发展。

需要进一步研究来探索miR-645和STING之间的调控机制。如通过深入研究miR-645和STING的相互作用界面和调控途径，可以揭示miR-645如何通过靶向STING基因调节结直肠癌的转移。此外，进一步的临床研究可以探索miR-645和STING的表达与结直肠癌患者预后的关系，以及其在免疫治疗中的潜在应用价值[3]。

总之，研究结果表明miR-645在结直肠癌中的高表达与STING的调控有关，可能参与结直肠癌的转移过程。这为深入研究miR-645和STING之间的相互作用、探索新的治疗靶点以及开发个体化治疗策略提供了新的线索和理论基础。进一步的研究努力将有助于加深对miR-645和STING的理解，并为结直肠癌的预后评估和治疗提供新的方向和策略。

3.2 miR-645对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响 miR-645对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响是本研究的重点之一。实验证实，miR-645的过表达显著增强了结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，而miR-645的沉默则呈现相反的效果。

这些发现表明miR-645在结直肠癌细胞迁移和侵袭过程中具有促进作用。miR-645的高表达可能通过调节与细胞迁移和侵袭相关的基因和信号通路，促进肿瘤细胞的转移和侵袭能力增强。进一步研究miR-645调控的靶基因，如转录因子、细胞黏附分子和基质金属蛋白酶等，可以更深入地揭示miR-645参与结直肠癌细胞迁移和侵袭的机制。这些研究结果对于理解结直肠癌转移过程的分子机制具有重要意义。进一步研究miR-645的功能和调控机制，可以为开发新的治疗策略和靶向治疗结直肠癌的方法提供理论基础。同时，miR-645可能成为评估结直肠癌患者预后和治疗反应的潜在生物标志物。因此，深入研究miR-645对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的调控，对于指导个体化治疗和改善患者预后具有重要的临床意义[4]。

3.3 miR-645对STING蛋白表达的调控 本研究还揭示了miR-645对STING蛋白表达的调控作用。通过实验证实，miR-645的过表达导致STING蛋白的表达下调，而miR-645的沉默则使STING蛋白的表达上调。这些结果表明miR-645通过靶向STING基因参与了结直肠癌细胞中STING蛋白的调控。STING作为免疫调节分子，参与调节细胞的免疫应答和抗病毒防御。miR-645的高表达可能导致STING的下调，从而减弱了免疫应答和抗肿瘤能力，促进了结直肠癌的发展和转移。进一步的研究需要探索miR-645调控STING的分子机制。可能的机制包括miR-645与STING基因的结合导致mRNA降解或翻译抑制，或者通过调控其他调节STING表达的信号通路和转录因子来影响STING的表达水平[5]。从临床角度来看，miR-645对STING的调控可能对结直肠癌患者的治疗和预后具有重要意义。结直肠癌患者的免疫状态和治疗反应与STING的表达水平密切相关。因此，miR-645的表达水平和对STING的调控可能成为结直肠癌患者预后评估和治疗决策的重要指标。

3.4 miR-645和STING作为治疗靶点的潜在应用 miR-645和STING作为治疗靶点的潜在应用是本研究的重要发现之一。miR-645的高表达与结直肠癌的恶性特征和不良预后密切相关，而STING作为免疫调节分子在肿瘤免疫应答中发挥重要作用。因此，针对miR-645和STING的调控可能成为新的治疗策略。一方面，通过抑制miR-645的表达或阻断其功能，可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，从而抑制肿瘤的转移过程。针对miR-645的治疗策略可以包括使用miRNA抑制剂或开发靶向miR-645的药物。另一方面，增强STING的表达或激活其信号通路，可以增强肿瘤细胞对免疫攻击的敏感性，促进肿瘤的免疫清除。目前已经有针对STING的免疫治疗策略在临床试验中展开，包括STING激动剂的使用和STING信号通路的调节剂。

因此，miR-645和STING作为治疗靶点具有重要的潜在应用。进一步的研究将有助于深入了解miR-645和STING在结直肠癌发展中的作用机制，为开发针对这些靶点的治疗策略提供理论基础。这些治疗策略有望为结直肠癌患者提供新的个体化治疗选择，并提高患者的治疗效果和预后。

总之，本研究揭示了miR-645对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的调控作用，以及对STING蛋白表达的调控机制。进一步的研究将有助于深入了解miR-645和STING之间的相互作用，以及其在结直肠癌发展和转移中的重要性。这些研究成果可能为结直肠癌的个体化治疗和预后评估提供新的思路和策略。