刘艳军 徐永平 李淑英 罗祥林 陈元维*

1. 太原工业学院材料工程系,山西 太原 030008

2. 大连赛姆生物工程技术有限公司博士后工作站,辽宁 大连 116600

3. 大连理工大学生物工程学院,辽宁 大连 116600

4. 四川大学高分子科学与工程学院,四川 成都 610065

由于具有良好的生物可降解性和生物相容性,聚乳酸组织工程支架广泛应用于骨缺损修复[1-3]。聚乳酸在体内通过酶解和水解最终生成乳酸,这是糖的一种代谢产物[4]。然而,在临床应用过程中,部分植入聚乳酸支架的患者出现无菌性炎症或骨溶解,可能原因是聚乳酸在体内降解引起微环境改变,抑制成骨细胞发挥功能,影响破骨细胞功能[5-7]。为了探究聚乳酸降解产物对细胞生长微环境的影响,已有研究利用乳酸调节培养基pH来探究乳酸对细胞增殖活性和成骨表型的影响,发现随着乳酸浓度增加(pH从7.4至6.8),乳酸对细胞增殖活性和成骨分化能力抑制作用增强[8]。研究表明,植入体内的聚乳酸支架降解产生大量乳酸,乳酸累积使微环境pH降至6以下[9-11]。He等[12]在体外研究乳酸的细胞毒性,并探究其对细胞碱性磷酸酶活性的影响,结果表明随着乳酸浓度增加(pH从7.4至5.5),其细胞毒性增大,细胞碱性磷酸酶活性降低。冯婷婷等[13]探究聚乳酸降解终产物乳酸对成骨样细胞增殖和成骨表型的影响,结果表明乳酸浓度增加(pH从7.4至5.5)会抑制细胞增殖能力,而低浓度乳酸(4 mmol/L)对细胞碱性磷酸酶活性和形成钙结节能力无影响,但高浓度乳酸对于细胞成骨表型的影响并未研究。此外,乳酸对I型胶原和骨钙素等成骨表型关键标志物的影响也未研究,因此聚乳酸降解终产物对细胞成骨矿化影响的机理尚不明确。

本研究利用聚乳酸降解终产物乳酸调节培养基的pH,模拟聚乳酸降解终产物对微环境的影响,用含不同浓度乳酸的培养基培养大鼠成骨样细胞,观察乳酸对细胞形态的影响,并检测与成骨密切相关的I型胶原、碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量和矿化钙结节形成情况,在分子水平探讨了细胞碱性磷酸酶mRNA表达情况,探讨聚乳酸降解终产物对细胞成骨矿化的影响机理,为聚乳酸骨支架的精确设计与体内应用提供参考意义。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和主要设备

实验所用细胞为大鼠成骨样细胞Ros17/2.8,购自四川大学华西医院;左旋乳酸溶液(L-LA)购自美国Alfa Aesar公司;DMEM培养基购自美国Gibico公司;青霉素、链霉素购自中国北京索莱宝公司;小牛血清购自中国北京圣马元亨生物制品研究所;ALP试剂盒购自中国北京柏定试剂公司;TRIZOL购自美国Molecular Research Center INC;逆转录试剂盒和PCR master mix购自美国赛默飞世尔科技公司;I型胶原和骨钙素ELISA试剂盒品牌为Novus Biologicals,购自美国Bio-Techne公司。

MCO-18AIC型细胞培养箱购自日本SANYO公司;IX51荧光倒置相差显微镜购自日本Olympus公司;实验所用的细胞培养板购自美国Corning公司;DNM-9606型酶标仪购自中国北京普朗公司;7300型Real time PCR仪购自美国ABI公司;VAPRO5520型露点渗透压仪购自美国Wescor公司。

1.2 方法

1.2.1含乳酸培养基的制备:分别配制乳酸浓度为8、16、22、27 mmol/L的培养基,将不含乳酸的培养基作为对照组,利用pH计和渗透压仪检测培养基的pH和渗透压。

1.2.2细胞形态观察:将细胞以4×104个/mL的密度接种于96孔培养板中,每孔200 μL,细胞培养箱温度为37 ℃,保持5 % CO2和饱和湿度,培养24 h后,吸去旧液,加入含乳酸培养基(8、16、22、27 mmol/L),不含乳酸培养基为对照组,培养3 d后,利用倒置显微镜观察并拍照记录。

1.2.3ALP活性检测:通过ALP试剂盒测定细胞ALP活性。按照1.2.2方法接种细胞,培养3 d后,吸去培养基,加入200 μL细胞裂解液0.1 % Triton X-100,放置过夜后,利用超声破碎细胞,测定细胞ALP活性。

1.2.4ELISA法检测I型胶原和骨钙素含量:通过ELISA试剂盒检测细胞I型胶原和骨钙素含量。按照1.2.2方法接种细胞,培养3 d后,按照使用说明测定I型胶原含量;每3天换一次液,培养7 d后,按照使用说明测定骨钙素含量。

1.2.5细胞矿化钙结节检测:将细胞以105个/mL的密度接种于24孔板内,培养24 h后,吸去旧液,加入含乳酸培养基(8、16、22、27 mmol/L),将不含乳酸培养基为对照组,培养3 d后,采用含矿化诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/LL-抗坏血酸)的正常培养基继续培养21 d。期间每3天换一次正常培养基,吸弃旧液,加入盐酸四环素浓度为100 μg/mL的正常培养基,培养30 min后,PBS清洗两遍,倒置荧光显微镜下观察拍照。利用Image Pro Plus 6.0软件,计算所生成的钙结节面积占总面积的百分比来进行钙结节定量分析,得到钙结节阳性面积比。

1.2.6实时定量PCR方法检测ALP mRNA表达:将细胞以105个/mL的密度接种于6孔板内,培养24 h后,吸去旧液,加入含乳酸培养基(8、16、22、27 mmol/L),将不含乳酸培养基为对照组,培养3 d后,裂解细胞,提取总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性检测并测定浓度,反转录成cDNA,然后利用实时定量PCR扩增目的基因,具体步骤如下:(1)样本稀释:每个标本取4 μL于200 μL无菌EP管中,然后加入16 μL无菌H2O稀释,充分混匀,于冰浴中按每管6 μL分装于PCR 8连管中备用;(2)实时定量PCR反应体系的配制:预混实时定量PCR反应液,其中H2O 4.7 μL,PCR master mix 12.5 μL,上下游引物及探针各0.6 μL,充分混匀后,分装于含cDNA模板的PCR管中。离心后,转移至实时荧光定量基因扩增仪中;(3)反应条件设置为:① 94 ℃ 2 min;② 94 ℃ 20 sec,50 ℃～60 ℃(依据引物的Tm值可变)30 sec,60 ℃ 40 sec,45个循环;于60 ℃ 40 sec时采集荧光。其中,ACTB复性温度为53 ℃;ALP复性温度为54 ℃;反应结束后,分析扩增动力学曲线,确定样品Ct值,并换算成相对于内参照基因的相对表达量。采用REST软件对所获得的Ct进行统计学处理。根据基因序列设计各基因的引物和探针,见表1。

表1 各基因的引物与探针序列

1.3 统计学分析

通过SPSS 21.0软件进行统计学分析,结果采用均数±标准差表示,组间比较通过单因素方差分析,检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 乳酸对培养基pH和渗透压的影响

如表2所示,与对照组(不含乳酸培养基)相比,含乳酸培养基的pH随乳酸浓度增加而降低,渗透压升高。

表2 不同培养基的pH值和渗透压

2.2 乳酸对细胞形态的影响

不同培养基培养细胞3 d后,发现对照组细胞呈长梭形,少量圆形,平行排列或呈漩涡状,细胞铺满了基底,如图2A所示。随着培养基中乳酸浓度增加,细胞的形态发生改变,长梭形细胞减少,圆形细胞数量增加,同时细胞数量减少,如图2B～图2E所示,当乳酸浓度增加至27 mmol/L时,细胞收缩变形,观察到少量长梭形细胞,排列不规则,数量明显减少。

图1 不同培养基中成骨样细胞的形态

图2 乳酸对细胞分泌I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素的影响

2.3 乳酸对细胞成骨表型的影响

培养基培养细胞3 d后,利用ELISA法测定I型胶原含量,如图3A所示,与对照组相比,低浓度乳酸组(8、16 mmol/L)的I型胶原量都显著高于对照组,其余组与对照组相比无显著差异;培养3 d后,检测细胞碱性磷酸酶活性,如图3B所示,与对照组相比,16、22、27 mmol/L组ALP活性随乳酸干预浓度的增加呈浓度依赖性下降,差异有统计学意义。当乳酸浓度为16、22、27 mmol/L时,细胞ALP活性分别为对照组的59.4%(P<0.05)、34.7%(P<0.01)和22.4%(P<0.01);培养7 d后,通过ELISA法测定骨钙素含量,如图3C所示,含乳酸组的骨钙素量与对照组之间没有显著差异(P>0.05)。

图3 不同培养基中所形成的钙结节

2.4 乳酸对矿化钙结节的影响

细胞在体外条件下经增殖期、分泌期和矿化期,最终以钙结节的形式生成钙盐沉积,经四环素染色后呈现黄色荧光[14-16]。如图3A～图3E所示,对照组中钙结节数量多,体积大,是由大量细胞堆积生成,与对照组相比,含乳酸组中所形成的钙结节数量少,体积较小。随着乳酸浓度增加,钙结节数量减少。当乳酸浓度为27 mmol/L时,完全没有钙结节生成。通过定量分析(图3F),与对照组相比,16、22、27 mmol/L组钙结节阳性面积随着乳酸干预浓度的增加呈浓度依赖性下降,差异有统计学意义。

2.5 乳酸对碱性磷酸酶mRNA表达的影响

培养3 d后,测定细胞ALP mRNA的相对表达量。利用动力学曲线读取Ct值,通过REST软件确定ALP相对表达量。如表3所示,当乳酸浓度为8 mmol/L时,ALP mRNA表达量为对照组的0.594,当乳酸浓度为16 mmol/L时,ALP mRNA表达量为对照组的0.104(P<0.01),显著低于对照组。

表3 不同培养基中细胞ALP mRNA的相对表达量

3 讨论

意外事故、运动损伤和骨科疾病通常会导致骨缺损[17-18]。人体骨具有一定的自愈能力,但通常情况下都需要植入骨组织工程支架来实现骨修复或重建[19-20]。然而患者常在聚乳酸支架植入处出现不良反应,主要因为聚乳酸降解终产物乳酸引起骨组织生理环境改变,影响细胞正常功能,导致骨组织处炎症和病变[5-6]。

本研究将不同浓度乳酸加入培养基来模拟聚乳酸降解终产物对微环境的影响,结果表明,对照组pH为7.2～7.4之间,渗透压为(318.7±1.5)mOsm/kg,此时酸度和渗透压与体内生理环境条件接近,能够满足细胞的生长和增殖要求[21]。当加入乳酸后,培养基的pH和渗透压改变,微环境改变会影响细胞的正常功能,尤其当pH低于6.8时,明显观察到细胞形态收缩,细胞间杂质增多,可能是低pH引起的酸中毒影响细胞的代谢活动。另外,高渗透压也会引起细胞皱缩。此外,还研究了乳酸对细胞成骨分化标志物的影响,主要有早期分化标志物I型胶原和碱性磷酸酶,晚期分化标志物-骨钙素[22-23]。结果表明,低浓度乳酸(8、16 mmol/L)对细胞分泌I型胶原有一定的促进作用,显著高于对照组。有研究表明乳酸和乙醇酸处理的成骨细胞更倾向于成为晚期成骨细胞,乳酸对于细胞分泌I型胶原具有促进作用,因此低浓度乳酸对细胞分泌I型胶原具有促进作用,笔者推测当乳酸浓度增大时,对细胞增殖的抑制作用增强,细胞数量减少,使得细胞分泌I型胶原总量减少[24]。乳酸浓度到达某一浓度时,其对细胞分泌I型胶原的促进与对细胞增殖的抑制共同作用下,高浓度的乳酸没有体现出促进作用。乳酸会抑制细胞碱性磷酸酶活性,并且随乳酸浓度增大,抑制作用增强,该结果与以前的报道基本一致,可能是因为酸性条件下细胞的基质Gla蛋白(一种矿化抑制剂)上调而导致碱性磷酸酶活性降低[24]。骨钙素是由成熟成骨细胞分泌一种非胶原蛋白,通过特异性吸附钙,在成骨晚期能够促进形成钙结节[25],乳酸对细胞骨钙素的分泌没有抑制作用,如图3C所示。

成骨细胞经体外培养诱导分化,形成矿化钙结节,最终完成骨矿化过程[26]。如图3所示,乳酸会抑制细胞的成骨矿化能力。成骨细胞的矿化过程十分复杂,多种调节因子都会对细胞的矿化过程发挥作用[27],根据实验结果(图3),乳酸通过抑制细胞碱性磷酸酶活性,从而影响成骨矿化能力。此外,细胞形态改变和数量减少,也会影响细胞的成骨矿化能力。碱性磷酸酶是成骨细胞早期成熟的主要标志物,其通过水解磷酸酯,提高磷酸根浓度,从而启动钙化过程[28],因此在分子水平上,笔者进一步研究了乳酸对于细胞ALP mRNA表达的影响。结果表明,随着乳酸浓度增加,细胞ALP mRNA相对表达量降低,乳酸抑制细胞碱性磷酸酶mRNA表达,这与碱性磷酸酶活性实验结果一致(图3B)。

聚乳酸植入物降解引起无菌性炎症或骨溶解,研究表明,聚乳酸降解终产物乳酸是引起上述症状的原因之一[7-12]。已有研究关注乳酸对成骨细胞成骨功能的影响,但乳酸影响成骨细胞矿化的机理还不明确。本研究探讨了乳酸对微环境的影响,重点研究乳酸对于成骨样细胞生长和成骨表型标志物的影响,在分子水平上进一步研究了乳酸对碱性磷酸酶mRNA表达的影响。聚乳酸降解终产物乳酸可抑制细胞ALP mRNA的表达,降低ALP活性,随着乳酸浓度增大,乳酸抑制作用增强,最终降低细胞的成骨矿化能力。此外,乳酸并不会抑制细胞分泌I型胶原和骨钙素,细胞形态改变和数量减少也可能会影响细胞的成骨矿化能力。

聚乳酸一直被认为具有良好的生物相容性和生物可降解性,然而实验结果表明,其作为骨组织工程支架需要面对诸多问题:如何控制其降解速度,使得降解产生的乳酸浓度控制在安全的浓度范围内,减少乳酸对微环境的影响;能否通过制备聚乳酸复合支架来避免乳酸对细胞碱性磷酸酶活性的不良影响,保持成骨细胞的成骨矿化能力。但总的来说,本研究结果仍然能够为聚乳酸骨组织工程支架的设计提供一定的参考意义。