孙明波 董健 郭芳 陈文博 王诗琪 蔡盼盼 刘浩 胡健 余洋 辽宁省检验检测认证中心 （辽宁 沈阳 110171）

内容提要： 目的：尝试建立壳聚糖肛肠抗菌凝胶的无菌检查方法。方法：严格按照《中华人民共和国药典》（2020版）四部 第1101条无菌检查方法，采用薄膜过滤法对壳聚糖肛肠抗菌凝胶进行无菌检查，并对建立的方法进行验证。结果：样品管无菌生长，六株阳性对照菌生长良好。结论：通过方法学验证说明建立的无菌检查法适用于壳聚糖肛肠抗菌凝胶的无菌检查，保证无菌检查方法的有效性。

壳聚糖具有抗菌、抗肿瘤、促进凝血等药理活性。天然资源丰富，无毒，具有良好的生物相容性和生物降解性。它已广泛应用于医学领域，如止血剂、止血敷料和可吸收外科缝合线等。近年来，越来越多地应用于妇科产品，如壳聚糖妇科栓剂、壳聚糖宫颈抗菌膜[1]。

卡波姆，也被称为聚羧乙烯，是一种由丙烯酸和丙烯基蔗糖交联而成的聚合物。它的化学名称是Carboxypolymethylene，最早是由美国的Goodrich公司生产的，现在被列入美国、英国和其他国家的药典，2000年版我国药典已收录[2]。卡波姆是一种高分子的聚合物，初始的状态是为白色的疏松的粉末状，可能会有轻微的臭味，而且还容易吸引潮气。卡波姆在许多行业中占有比较重要的地位。作为一种多用途高分子材料和药物辅料，卡波姆被广泛应用于国内外药品和化妆品的开发和生产，具有广泛的应用前景。将该物质放入在水中，加入10%的氢氧化钠溶液之后就会变成凝胶状，可以运用于化妆品的生产，对皮肤有一定的保护作用。在化妆品的生产中添入适量的卡波姆能够使霜膏乳液变得具有流动性，还能增加产品的稳定性和美观性，且卡波姆在溶解成黏稠的透明质物体时还具有一定的保湿的效果。卡波姆与皮肤有一定的亲和力，把卡波姆加入护肤品中，能够减少刺激性物质的对皮肤和黏膜的刺激和伤害，能够抗紫外线，增强皮肤对紫外线的抵抗能力，减少紫外线对皮肤的伤害，所以很产品用它来做防晒霜的成分。同时，因为其本身就是一种天然的药用成分，具有一定的消炎杀菌的作用，所以也可常见于一些药妆成分，其可以通过一些综合作用来保证化妆品的质量。此外，卡波姆也被运用于医疗方面，比如在做B超的时候会使用耦合剂，卡波姆能够起到很好的介质作用。

由于卡波姆的凝胶性状以及壳聚糖的抗菌性，如何针对这两种特性建立一种合理有效的无菌检测方法一直是一个难题。本文结合《中华人民共和国药典》[3]（2020版），四部 第1101条无菌检查方法，建立了壳聚糖肛肠抗菌凝胶无菌检测的一般流程，为改进该产品的无菌检测方法提供参考。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试验起止时间：2022年8月～2023年3月。

1.1.1 试验仪器及耗材

集菌仪（HTY-2000A）（杭州高得医疗器械有限公司）；可重复性使用薄膜过滤器（杭州泰林生物技术有限公司）；一次性全封闭集菌器（杭州泰林生物技术有限公司）；50μm微孔滤膜（海宁市盐官创为过滤器材厂）；生物安全柜（HFsafe-1200）（上海力申科学仪器有限公司）；生化培养箱（沈阳市伟明医疗设备厂）。

1.1.2 供试品

壳聚糖肛肠抗菌凝胶，规格：3g，由生产厂家提供。

1.1.3 试验菌种

试验用白色念珠菌[CMCC（F）98001]（Candida albicans）、黑曲霉[CMCC（F）98003]（Aspergillus niger）、生孢梭菌[CMCC（B）64941]（Clostridium sporogenes）、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]（Escherichia coli），六株试验菌均来自中国食品药品检定研究院。

1.1.4 培养基及试剂

液体硫乙醇酸盐培养基（FTM）（德国默克公司）、胰蛋白酶大豆蛋白胨液体培养基（TSB）（德国默克公司）、沙氏葡萄糖琼脂（TSA）（美国BD公司），以上培养基均通过培养基灵敏度的检查；蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；吐温80（国药集团化学试剂有限公司）；0.9%无菌氯化钠溶液（辽宁民康制药有限公司）；无水氯化钙（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌新鲜培养物接种于胰蛋白酶大豆琼脂培养基中，将生孢梭菌新鲜培养物接种于液体硫乙醇酸盐培养基中，在30°C～35°C生化培养箱中培养18～24h。将白色念珠菌新鲜培养物接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20°C～25°C生化培养箱24～48h。用0.9%无菌氯化钠溶液将上述培养物配制成100 CFU/mL以内的菌悬液。将新培养的黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，置于生化培养箱20°C～25°C培养5～7d。加入3～5mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗脱孢子。然后采用适当的方法将孢子悬浮液吸入无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液制备含菌量＜100CFU/mL的孢子悬浮液。

1.2.2 方法验证

1.2.2.1 样品前处理

用100mL 0.1%无菌蛋白胨缓冲溶液稀释15支样品，再加入10%无菌氯化钙溶液溶解，加入时摇匀。此时二价离子与羧酸自由基结合形成不溶性盐，逐渐产生大量絮凝沉淀，边加边震荡摇匀，直至沉淀量不再增加，使用约200mL氯化钙溶液。

1.2.2.2 通过滤膜1的滤液中微生物的回收率

以金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]和白色念珠菌[CMCC（F）98001]为试验菌，将试验菌新鲜培养物（0～100CFU）加入到供试品溶液中，按1.2.2.1步骤操作，采用可重复性可灭菌薄膜过滤器滤筒，将絮状混合物通过50μm滤膜1，在无菌滤膜1上分离沉淀，收集所有滤液[4]。将收集的所有滤液进行薄膜过滤，计数，计算回收率。

1.2.2.3 无菌试验方法的验证

使用可重复灭菌的薄膜过滤器，无菌操作组装孔径为50μm的过滤膜（过滤膜1）。试验产品溶液全部过滤后，将所有滤液收集。采用封闭式三联无菌薄膜过滤器（滤膜2），过滤收集的所有滤液，将试验用菌（生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]＜100CFU的菌悬液加入到滤筒中。取另一容器，用相同体积的培养基，加入相同数量的试验菌，作为阳性对照，根据规定的温度培养3～5d。所有检测用试验菌均用相同的方法进行操作，并分别设立阴性对照组。

1.2.3 无菌检查试验

取15个样本，用100mL0.1%无菌蛋白胨缓冲液充分混匀，然后加入10%无菌氯化钙溶液溶解，氯化钙溶液总用量约为200mL。使用可重复灭菌的薄膜过滤器滤筒，无菌操作组装孔径为50μm的滤膜（滤膜1）。试验产品溶液过滤后，将通过滤膜1的所有滤液收集。选用封闭的三联无菌过滤器（滤膜2），用来过滤所有收集的滤液。阳性在滤筒中加入＜100CFU试验菌。按规定温度培养14d，观察结果。

2.结果

2.1 菌液制备结果

每种试验菌液经相应条件培养后生长良好，均为混浊，同步进行菌液计数，结果见表1。

表1 .验证用菌液的稀释级及接种量

2.2 经过滤膜1过滤后，收集液中的微生物回收率

以金黄色葡萄球菌和白色念珠菌为试验菌，通过50μm滤膜1后，回收率结果见表2。

表2 .滤膜1微生物的回收率(%)

2.3 薄膜过滤法验证结果

采用薄膜过滤法进行的方法学验证结果见表3。从表3可以看出，试验品组和阳性对照组均生长良好，且生长速度相同，结果表明用双滤膜法进行试验时，可去除供试品对6株阳性菌的抑菌作用，可用此方法进行供试品的无菌检查。

表3 .壳聚糖肛肠抗菌凝胶的方法验证结果

2.4 供试品的无菌检查

由表4可知，供试品管与阴性管均澄清，阳性管生长良好，供试品符合规定。

表4 .供试品无菌检查结果

3.讨论

壳聚糖作为抗菌剂已被科研工作者研究多年，虽然到目前为止具体的抗菌机制尚未清楚，但学者们提出了很多较为合理的抗菌机制。郑连英等[5]认为壳聚糖的抗菌作用主要有以下两种机制：一种是通过吸附在细胞表面，形成一层高分子膜，阻止营养物质的运输；另一种是渗透进细胞内，发生絮凝作用。宋献周等[6]认为其抗菌机制为通过某种途径进入菌体细胞内并扰乱其生理代谢实现的。

卡波姆凝胶具有良好的生物黏附性，可通过长时间黏附黏膜独特的结构和分泌物部位，将所含药物释放到治疗部位，从而达到较好的治疗效果。此外，它在控制药物释放、提高药物生物利用度和定位给药方面也具有日益显著的优势。目前，卡波姆凝胶在皮肤、黏膜和口腔给药途径中发挥着越来越重要的作用。由于碳链之间的共价交联，卡波姆形成了独特的网络结构。水化膨胀后形成凝胶，作为缓释控释剂中的水凝胶骨架材料，通过形成的凝胶层控制药物释放。因其形成凝胶具有黏性，堵塞微孔滤膜，故需要先通过加入无菌氯化钙形成不溶性盐，产生大量絮状沉淀，初步过滤后再进行无菌试验的薄膜过滤，因此在滤膜1的选择上需要进行研究。

细菌长度一般在0.1～20μm，横径0.2～2μm，肉眼难以分辨细菌，只有通过显微镜放大1000倍后，才能辨别细菌的大小、形态、分布和染色特性[7]。相比于细菌，霉菌的基本单位称为菌丝，呈长管状，宽度2～10μm，可不断自前端生长并分枝。无隔或有隔，具1至多个细胞核。酵母菌在分类上属于子囊菌亚门，是单细胞真菌，代表为啤酒酵母菌，形态呈圆形卵圆形，长5～30μm[8]。因此本试验选用50μm孔径尼龙滤网，其主要由聚丙烯纤维纺织成型构成一体，耐酸碱性，耐腐蚀，阻力较低，且可反复清洗，经济性极高。卡波姆凝胶与无菌氯化钙络合形成不溶性盐，产生的絮状沉淀经过50μm孔径尼龙滤网过滤后，收集的滤液进行微生物计数，回收率可达到90%以上，说明可用50μm孔径尼龙滤网对絮状混合物进行初步过滤，收集到的滤液能够通过0.45μm孔径，通过此方法可去除供试品对6株阳性菌的抑菌作用，因此可用此方法进行卡波姆凝胶类供试品的无菌检查。

随着2020版药典的发布，微生物的检验标准有了新的提高，我国药品、医疗器械的微生物检验控制体系与国际通行标准全面接轨，由于药品、医疗器械品种的多样化、复杂化，无菌检查的方法学建立是十分必要的。针对于含壳聚糖类的凝胶产品的无菌检验方法，总结了如下几点注意事项：①供试品的选取、转移过程要采取防止污染措施，确保试验结果的可靠性。②供试液制备时，选用足够体积的无菌氯化钙进行络合，以免络合不充分影响下一步的过滤。③要选择合适孔径的滤膜，既不能选择孔径太小的滤膜，以免影响经过滤膜1过滤的滤液的微生物回收，造成无菌假阴性结果，也不能选用孔径太大的滤膜，以免因为滤液中残留的絮状物在做无菌检查时难以通过滤膜。④由于试验为开放式膜式过滤器，需要配制试验溶液、更换滤膜、收集滤液等多个步骤，污染因素增加。因此，在本试验的操作中应严格遵循无菌操作原则，避免因操作不规范而产生假阳性结果。