罗洋 陈思彬 李娜 孙惠丽 天津市医疗器械质量监督检验中心 （天津 300384）

内容提要： 目的：通过细菌回复突变试验（Ames试验）评价聚乙烯醇栓塞微球潜在的遗传毒性，从而来评价该材料的潜在致突变性。方法：选择生理盐水（0.9%氯化钠水溶液）、二甲基亚砜（DMSO）和含10%血清培养基（R10）三种介质对试验样品进行浸提，采用平板掺入法计数鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100及TA102在活化和非活化条件下的细菌回复突变菌落数，以检测其致突变性。结果：阴性对照组和阳性对照组的试验结果成立。聚乙烯醇栓塞微球采用生理盐水、DMSO和R10浸提后，浸提液对试验所用菌株回复突变数均未超过阴性对照的2倍。结论：在本次试验条件下，栓塞微球浸提液均对鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102无诱变性。

介入栓塞治疗学作为一门新兴学科，在治疗心血管疾病、恶性肿瘤方面有着良好的应用前景，是一种有效且损伤小的治疗方式。栓塞微球作为一种最热门的栓塞材料因为其可控的尺寸与球度能很好地改善栓塞效果来满足临床需求[1]。栓塞微球载体材料具有表面光滑、均匀的悬浮能力，在子宫肌瘤动脉栓塞术中能减少并发症且防止复发[2,3]。与传统的治疗手段相比，用聚乙烯醇可载药栓塞微球治疗中晚期肝癌患者具有手术效果好且并发症较少的效果[4,5]。目前国内外上市销售的栓塞微球均为聚乙烯醇聚合微球，通过永久性栓塞达到良好的治疗效果，但其远期效果与安全性还有待时间的检验[6]。

细菌回复突变试验（Ames Test，简称Ames试验）是一项体外评价受试物致突变性的试验，具有试验周期短、方法简便且结果稳定的特点因而广泛应用于食品、药品、医疗器械和农药等领域[7]。通过检索文献发现，目前常用浸提介质一般都为生理盐水（0.9%氯化钠水溶液）和二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），几乎没有文献报道过使用含血清培养基来充当浸提介质的[8-10]。但是DMSO作为有机溶剂对很多心血管植入类产品有溶解作用，因此找到合适的兼具极性与非极性特性的浸提介质具有相当的必要性和紧迫性。利用多种浸提介质，使用Ames试验检测聚乙烯醇栓塞微球的研究更是少见。

本研究使用生理盐水、二甲基亚砜和含10%血清培养基三种浸提基质进行试验，通过Ames试验检测聚乙烯醇栓塞微球材料的致突变性，为评价该材料体外遗传毒性的潜在风险和相关产品的生物安全性评价提供数据，从而为广大人民的用械安全奠定坚实的基础。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试验起止时间：2022年5月～2023年1月。

试验菌株：菌株（TA97a，TA98，TA100，TA102）来源于MOLTOX公司。各菌株进行组氨酸缺陷型、脂多糖屏障缺失、R因子、紫外线损伤修复缺陷型、四环素抗性和自发回复率鉴定合格后备用。

1.2 方法

1.2.1 试验材料与浸提液制备

1.2.1.1 试验样品

来自甲厂家的A产品：选择规格为2mL:7mL（2mL栓塞微球:7mL生理盐水），直径为300～500μm，材质为聚乙烯醇的栓塞微球。

来自乙厂家的B产品：选择规格为绿色型（1g栓塞微球:7mL磷酸盐缓冲盐溶液），直径为900～1200μm，材质为聚乙烯醇的栓塞微球。

1.2.1.2 浸提液制备

浸提介质采用生理盐水，二甲基亚砜（DMSO）和含10%马血清的1640培养基（R10）。A产品取样前经滤纸过滤，取微球按照0.2g/mL比例加入浸提介质，放置于（50±2）°C摇床（72±2）h充分振荡浸提，B产品同法制备。

1.2.1.3 对照样品的制备

阴性对照组：取上述同批号介质10mL，于相同条件下制备。

阳性对照组：非活化试验组（-S9）：0.5mg/mL敌克松(Dexon)。活化试验组（+S9）：TA97a、TA98、TA100菌株采用0.2mg/mL 的2-氨基芴；TA102菌株采用10μL/mL的甲基磺酸甲酯。

1.2.2 试验方法

1.2.2.1 培养基制备

使用遗传毒性Ames试剂盒A盒和B盒（北京汇智和源生物技术有限公司），按照试剂盒说明书配制底层和顶层培养基，经高温高压蒸汽灭菌。底层培养基每皿20mL，凝固后倒置于37°C培养箱内检菌备用。顶层培养基现配现用，灭菌后分装至2mL小管内备用。

1.2.2.2 活化与非活化系统

按照表1将各组分混匀后倾注至底层平板，室温固化。每组均设置3个平行皿。S9空白液和S9活化系统的配制方法详见试剂盒说明书。

表1 .测试混合体系

1.2.2.3 培养

全部平皿倒置于37°C培养箱中培养72h后观察结果并计数。

2.结果

2.1 评价依据

计数并记录每一平板的回复菌落数，并计算出3个平板的平均值，以±s表示。阴性对照组回复菌落数应在预期的范围内，阳性对照组回复菌落数应至少为阴性对照组的3倍，否则对不在范围内的菌株应重新试验。在背景生长良好条件下，试验样品组回复菌落数至少为阴性对照组回复菌落数的两倍或两倍以上（即回复菌落数≥2×阴性对照组数）即为阳性反应。如回复菌落数的增加与剂量相关具有统计学意义，或者至少在一个剂量水平出现可重复的并有统计学意义的阳性反应时，即可认为试验样品为阳性诱变剂。

2.2 计数与结果统计

A产品和B产品各浸提液组试验结果见表2、表3。

表2 .A产品各浸提液组试验结果(n=3,±s)

表2 .A产品各浸提液组试验结果(n=3,±s)

组别TA97a TA98 TA100 TA102生理盐水浸提液135±5 35±1 155±1 299±5生理盐水阴性对照 135±3 33±2 162±4 300±4 DMSO浸提液128±6 40±3 136±4 287±8 DMSO阴性对照125±2 37±4 144±5 307±10 R10浸提液119±4 44±3 131±1 268±3 R10阴性对照138±3 46±2 150±2 289±6阳性对照2540±86 1281±39 1313±60 1566±89-S9生理盐水浸提液124±3 31±4 147±5 266±7生理盐水阴性对照 142±5 43±2 129±3 292±4 DMSO浸提液156±9 46±5 140±2 276±1 DMSO阴性对照144±6 38±1 159±8 299±6 R10浸提液129±2 43±4 138±1 260±4 R10阴性对照141±2 35±2 149±8 283±8阳性对照2188±48 1988±38 1443±41 1895±40+S9

表3 .B产品各浸提液组试验结果(n=3,±s)

表3 .B产品各浸提液组试验结果(n=3,±s)

组别TA97a TA98 TA100 TA102生理盐水浸提液148±4 43±2 144±2 274±9生理盐水阴性对照 156±3 40±2 139±4 269±5 DMSO浸提液147±2 42±2 146±3 278±8 DMSO阴性对照157±8 40±2 141±4 277±3 R10浸提液133±5 38±3 136±6 288±3 R10阴性对照140±2 42±2 148±3 272±7阳性对照2880±87 1061±55 1191±53 1368±94-S9生理盐水浸提液152±12 44±4 153±1 275±5生理盐水阴性对照 148±3 42±2 147±6 285±5 DMSO浸提液160±5 38±1 165±7 282±3 DMSO阴性对照146±1 45±2 141±4 298±9 R10浸提液155±4 45±3 144±1 266±3 R10阴性对照165±8 49±5 166±6 292±7阳性对照2025±104 2049±94 1228±39 2049±80+S9

2.3 结果判定

通过结果可以看出，在本试验活化和非活化条件下，阴性对照组细菌回复突变菌落数在预期范围内，阳性对照组回复菌落数大于阴性对照回复菌落数的3倍，试验成立。A产品和B产品0.2g/mL试验样品生理盐水、DMSO和R10浸提原液对试验所用菌株TA97a、TA98、TA100、TA102 四株菌株的回复菌落数均小于2×阴性对照组回复菌落数，对所用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型均未发现诱变性。

3.讨论

本文考察了来自不同厂家的聚乙烯醇栓塞微球的遗传毒性，结果显示该材料具有一致的遗传毒特性即无致突变性。至少可以判断来自不同厂家的产品A和产品B可能具有相似的原材料以及生产工艺。当然，同一种材料在某种应用中被认为不具有不良的生物学反应，但在其他应用中未必成立。因此，对于不同工艺但主体成分一致的产品，在没有充分试验数据论证其一致性的前提下，应该采取谨慎的态度。

目前，很多遗传毒性试验研究都是建立在一种浸提介质即生理盐水上进行的。但是GB/T 16886.12-2017[11]中规定浸提时应使用极性和非极性两种溶剂，且非极性浸提介质建议使用植物油。因此一种浸提介质是不能满足生物相容性遗传毒性评价的。本实验室使用棉籽油作为阴性对照进行细菌回复突变试验后发现，棉子油会浮在凝固的顶层培养基上。如果使用植物油作为浸提介质，会导致试验样品植物油浸提液在试验及培养过程中无法与试验菌株充分接触从而失去检测的意义。尤其值得指出，DMSO作为常用的浸提介质大量运用于Ames试验，但是对于会溶解其中的植入器械而言是不适用的。GB/T 16886.12-2017也允许使用含血清培养基进行浸提，但在各试验室较少运用且未规定血清含量。本次试验使用了含10%血清培养基作为一种兼具极性与非极性特性的介质，试验过程和结果均显示其结果的可靠性与稳定性。为不适用DMSO浸提的医疗器械产品提供了新的浸提液选择。本研究为含血清培养基具体运用于医疗器械浸提液制备过程中提供了数据。本文使用3种浸提介质可以模拟人体内复杂的生理生化环境，为全面评价栓塞微球的遗传毒性提供了依据。

作为一款新兴且理想的材料，聚乙烯醇栓塞微球在具有良好的栓塞效果的同时应该具有良好的生物相容性以保证患者的用械安全。但目前栓塞微球的研究主要集中在理化性能如外观、弹性、粒径溶胀率等，优化制备过程如利用乳化-化学交联法获取最佳的聚乙烯醇微球制备条件、制备阿霉素载药微球以扩展预期用途，增加应用场景（如将造影剂与微球球体结合来实现治疗肿瘤血管栓塞的同时实现实时观察问题以及利用兔模型评估肝动脉栓塞微球治疗肝癌功效）的研究上，很少有文献报道该材料的遗传毒性[12-15]。当然，生物相容性评价是一个广泛而复杂的工作，Ames试验只是其中一个环节。还需要更多的体外和体内试验来全面评估栓塞微球的性能。