抗生素耐药机制与新抗感染措施研发

2023-09-10谢建平

四川师范大学学报（自然科学版） 2023年6期

谢建平, 黄煜, 宋洁

(西南大学生命科学学院现代生物医药研究所/三峡库区生态环境与生物资源省部共建国家重点实验室培育基地, 重庆 400715)

抗生素指由生物(多指微生物,包括细菌、真菌、放线菌属等)在生活过程中产生的、具有抗病原体活性的一类化学物质或者全化学合成的物质.抗生素的发现与应用是20世纪最伟大的医学发现之一.但随着时间的推移,微生物对抗生素产生了耐药性.2022年,全球约130万人的死亡与抗生素耐药性有关,如果抗生素耐药问题仍无法得到有效解决,预计2050年,全球每年将有1 000万人死于抗生素耐药菌感染,造成的直接经济损失将超10万亿美元.为解决抗生素危机需深入理解抗生素耐药机制并提出新的抗感染措施.本文将概述抗生素的使用现状、抗生素耐药机制、噬菌体以及抗毒力因子治疗作为新抗感染措施的应用现状.

1 抗生素的分类

自1929年青霉素发现以来,人们又发现了链霉素、红霉素、卡那霉素等抗生素,抗生素发展进入了黄金时期.近年来,受抗生素研发领域发展、全球传染病及慢性病发病率增加等多个因素影响,抗生素市场保持上升趋势.Market Research调查数据显示,2021年全球抗生素市场规模为425亿美元,2029年预计达605亿美元,年平均复合增长率4.5%.目前临床使用的抗生素根据化学结构可大致分为β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类等.抗生素主要通过靶向细菌的基本生理过程,如DNA、RNA、细胞壁或蛋白合成等发挥作用.根据抗生素的作用靶点,对目前临床上使用的抗生素进行分类,见表1.

1.1 抑制DNA复制DNA的复制需要拓扑异构酶催化DNA双链的断裂和连接,从而解决DNA拓扑异构问题,因此,拓扑异构酶也是抗生素的关键靶点之一.氟喹诺酮类抗生素的靶点就是DNA拓扑异构酶II和IV.DNA拓扑异构酶发挥作用时会和DNA分子结合形成拓扑异构酶-DNA二元复合物.而氟喹诺酮会与其形成复合体.氟喹诺酮与拓扑异构酶结合后,拓扑异构酶无法重新连接DNA底物;此时已经与拓扑异构酶结合的DNA片段被称为裂解复合物.裂解复合物的形成是氟喹诺酮杀菌的关键点,后续的杀菌机制根据作用途径可以分为2种.一种是依赖蛋白合成的杀菌途径,一种是不依赖蛋白合成的杀菌途径[1].第一代喹诺酮药物比如萘啶酸通过第一种途径发挥作用,新一代的氟喹诺酮如莫西沙星通过后一种途径行使功能.这2种途径最后都会造成染色体DNA碎片化并最终使细胞死亡.此外,裂解复合物会阻止DNA复制叉的移动并诱导SOS压力反应,会导致DNA修复相关基因的上调并抑制细胞分裂.低浓度的氟喹诺酮会抑制细菌DNA的合成,高浓度的氟喹诺酮会造成细菌死亡[2].

表 1 抗生素分类

1.2 抑制RNA合成RNA合成也是抗生素重要靶点.利福平是临床上具有代表性的RNA合成抑制类抗生素.利福平与RNA聚合酶的β-亚基(由rpoB编码)的亲和性高,与RNA聚合酶结合时会阻止合成新RNA[3].利福平只会阻止合成新RNA,不会阻止已合成RNA的延伸.其他RNA聚合酶抑制剂可以抑制RNA的延伸[4].利福平可以杀死革兰氏阳性菌和阴性菌,包括结核分枝杆菌,是一线抗结核药物.

1.3 抑制蛋白质的合成细菌mRNA的翻译过程主要涉及3个阶段(起始、延伸和终止),且翻译需要核糖体和一系列细胞质辅助因子的参与.细菌的核糖体通常由30S和50S核糖体核蛋白亚基组成,而抗生素通常也通过靶向这2个亚基而抑制蛋白质的合成.大环内酯类、林可酰胺类、氯霉素类和恶唑烷酮类抗生素通过靶向50S核糖体亚基发挥作用[5-6];氨基糖苷类和四环素类抗生素则通过靶向30S核糖体亚基发挥作用.靶向50S核糖体亚基的抗生素可以阻止肽基tRNA进入核糖体,随后通过空间位阻作用抑制肽基转移酶的延伸反应,并最终引发tRNA的解离.四环素类抗生素也可阻止tRNA进入核糖体[7].氨基糖苷类抗生素通过与30S核糖体亚基的16S rRNA结合,从而引起核糖体处的mRNA和tRNA的复合物的错配,导致蛋白质的错误翻译[8].大部分核糖体抑制型的抗生素都是抑菌类抗生素,但在特定物种或特殊处理条件下也能杀菌.如氯霉素可以杀死肺炎链球菌[9],大环内酯类的阿奇霉素也被证实可以杀死流感嗜血杆菌[10].

1.4 抑制细胞壁的合成肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分之一,它是由N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸与短肽聚合而成的多层网状聚合物.细胞壁可维持细菌体内的渗透压稳定,因此,对细菌在各种压力条件下的生存起着至关重要的作用.转糖苷酶和青霉素结合蛋白(PBPs,也称作转肽酶)是肽聚糖合成过程中的2个关键蛋白,前者添加二糖五肽从而延长肽聚糖的聚糖链,而后者是交联未成熟肽聚糖单元的相邻肽链[11].β-内酰胺类抗生素和糖肽类抗生素是常见的干扰细菌细胞壁合成的抗生素.β-内酰胺类抗生素通过抑制PBPs催化的肽键形成反应,从而阻断肽聚糖层的交联[12];而糖肽类抗生素(万古霉素)通过与肽链中的D-丙氨酰-D-丙氨酸结合来抑制交联,从而阻止肽聚糖的合成[13].临床上使用的环肽(多粘菌素B和粘菌素)和脂肽(达托霉素)也可通过诱发离子泄露而引起细胞膜去极化进行杀伤[14].由于万古霉素和达托霉素都能抑制细菌细胞壁合成,临床上也常将这2种抗生素和β-内酰胺类混合使用以治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)引发的感染[15].除了靶向肽聚糖以外,抗生素也可通过靶向细胞壁的其他成分而发挥作用.如异烟肼和乙硫异烟胺抑制分枝杆菌枝菌酸的合成,阻断细胞壁的合成;阳离子肽与细胞壁脂多糖中的脂质A结合,提高外膜通透性,导致细菌死亡[16].

1.5 抑制细菌代谢细菌代谢也是抗生素的重要靶点.抗生素可通过靶向细菌能量代谢、脂质代谢和碳代谢等发挥作用.参与能量代谢的F1Fo-ATP合酶、II型NADH脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶和甲基萘醌生物合成途径等,都有望成为新一代药物靶点[17-18].

贝达喹啉(Bedaquiline,BDQ)是靶向分枝杆菌能量代谢的药物,抑制分枝杆菌F1Fo-ATP合酶,造成细菌能量耗竭而达到杀菌目的[19-20].BDQ可结合于分枝杆菌ATP合酶的a亚基(基因atpB编码)和c亚基(基因atpE编码)接触区域[21],并通过多种相互作用与c环特异性结合.BDQ与c亚基的Glu65残基结合破坏了a、c亚基之间的联系,导致了质子泄漏,最终造成质子流与ATP合酶的解耦[22],使细菌ATP合成受阻.咪唑吡啶(Telacebec,Q203)是一种通过与细胞色素bc1(电子传递链ETC复合物III)的QcrB亚基结合而产生抑制作用的药物,它迫使细菌使用产能效率更低的细胞色素bd末端氧化酶[23].Q203和BDQ分别抑制呼吸链上的两大组分,当呼吸链出现一处突变时,多个呼吸链抑制剂可以共同阻止耐药的出现.氯法齐明(Clofazimine,Cfz)是分枝杆菌的另一种呼吸抑制剂,它作为II型NADH脱氢酶的竞争性底物可以导致活性氧的产生,对缺氧、非复制状态的结核分枝杆菌具有强杀菌效果[24].

叶酸是细菌中介导一碳单元转移的重要辅因子,它可以参与细菌的蛋白质、核苷酸的合成.外源的叶酸不能透过细菌细胞壁,因此细菌必须从头合成叶酸.甲氧苄啶就是通过靶向细菌的二氢叶酸还原酶而干扰细菌的叶酸合成[25].此外,磺胺甲恶唑通过靶向细菌的二氢叶酸合成酶影响细菌的叶酸合成,临床上磺胺甲噁唑经常和甲氧苄啶联用以治疗细菌感染.

2 抗生素耐药机制

抗生素使因细菌性感染导致的死亡人数下降了约70%[26],但随着抗生素长期的不合理使用,细菌已经进化出多种机制对抗抗生素(图1).目前,在细菌的个体层面,抗生素的耐药机制大致可以分为4个方面.(I)减少细胞内抗生素的浓度(降低渗透性和提升抗生素的外排);(II)抗生素靶点的修饰或改变;(III)抗生素的修饰或破坏;(IV)避开抗生素靶向的代谢途径.此外,细菌也可以在群体层面通过形成生物膜对抗抗生素.

图1 抗生素耐药机制[27]

2.1 降低抗生素的渗透性抗生素需要进入细菌与靶点接触才能发挥作用.革兰氏阴性菌的双层膜结构,使其对大多数抗生素具有耐药性.而革兰氏阳性菌缺乏细胞外膜,因此其对更多抗生素更具渗透性.分枝杆菌还具有外部脂质层和多糖包膜,因此可以阻止亲水类抗生素的渗透[28].革兰氏阴性菌的外膜是一个复杂的复合体,它既能提供保护,又能帮助细菌摄取环境中的营养.结构研究发现肠杆菌的外膜渗透率在细菌生长的过程中动态变化,并会影响抗生素进入细菌的能力[29].外膜包含孔蛋白,不同的抗生素可以识别不同的孔蛋白而进入细菌.过去认为孔蛋白对抗生素的透过有选择性,但最近的研究表明,底物的扩散以自发、被动的方式发生[30].鉴于孔蛋白的重要性,因此孔蛋白结构的改变是导致抗生素耐药的重要因素之一.比如,临床分离的耐药大肠杆菌在OmpC处存在多个突变,这些突变会改变孔蛋白的电荷,进而影响抗生素的进入[31].铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌也具备多种特定的通道蛋白,这些蛋白限制了大于200 Da的分子进入[32].

在细菌中,为了应对各种环境刺激,孔蛋白是受到严格调控的.其中最具代表性的研究就是大肠杆菌的OmpC和OmpF,这2个孔蛋白会受到EnvZ-OmpR双组份系统的调控.EnvZ是一个细胞周质的感应蛋白,它可以感应环境压力从而改变OmpR的磷酸化状态.高度磷酸化的OmpR可以刺激OmpC的转录从而改变细菌的耐药能力[33].因此,孔蛋白的调控蛋白也是未来抗生素开发的靶点之一.结核分枝杆菌虽然不具典型的孔蛋白结构,但其编码的PPE51蛋白也具有相似的功能.目前筛选出的小分子3bMP1(图2)通过靶向PPE51蛋白,在体外具有良好的抗结核作用[34].

2.2 抗生素外排除了阻止抗生素进入体内,细菌也可通过外排泵主动外排各种有毒化合物.在革兰氏阴性菌中,外排泵与双层细胞膜协同作用,使其对多种抗生素耐药.不同的外排泵对抗生素的影响并不相同,一些提供高水平的耐药性,另一些则提供低水平的耐药性,且外排泵对底物存在一定的选择性[35].外排泵可以分为6个蛋白家族,其中ATP结合盒蛋白家族(ATP-binding cassette,ABC)是以ATP作为能量来驱动运输,而主要协助转运蛋白超家族(major facilitator superfamily,MFS)、多药及毒素外排转运蛋白(multidrug and toxin extrusion,MATE)家族、小多药耐受蛋白(small multidrug resistance,SMR)家族、耐药-结瘤-分裂(resistance-nodulation-cell division,RND)蛋白家族和动杆菌抗菌化合物外排家族(proteobacterial antimicrobial compound efflux,PACE)由跨膜离子梯度中捕获的电化学能量提供动力[36].革兰氏阴性菌中,RND外排泵可运输各种结构不同的抗生素,因此RND蛋白家族和菌株耐药水平密切相关[36].在结核分枝杆菌中,也报道了多个与耐药相关的外排泵基因.如MFS蛋白家族分子EfpA与异烟肼、氟喹诺酮、利福平、氯法齐明的耐药水平相关[37];SMR蛋白家族分子Mmr与氧氟沙星、利福平的耐药相关[38];RND蛋白家族分子MmpS5-MmpL5与贝达喹啉的耐药水平相关[39].

2.3 抗生素靶点的改变、修饰和保护抗生素与靶点的高亲和力是抗生素发挥作用的基础.如果抗生素靶点发生突变或被其他分子修饰或保护,那么抗生素与靶点的结合能力会降低,从而对抗生素产生耐药性.比如氟喹诺酮靶向的DNA促旋酶AB亚基各有一段氟喹诺酮抗性决定区,该区域的氨基酸突变会降低DNA促旋酶和氟喹诺酮的结合能力,从而改变细菌对氟喹诺酮的耐受能力.临床分离的大肠杆菌中的PBP3基因突变也会降低对β-内酰胺抗生素的敏感性[40].

此外,对药物靶点的修饰也能提高细菌对抗生素的耐药性.细菌可以通过核糖体甲基转移酶将16S rRNA甲基化,从而降低其与大环内酯类抗生素的结合能力[41].16S rRNA的甲基化也与氨基糖苷类抗生素的高耐药性相关[42].细菌也能编码蛋白对抗生素的靶点进行保护,最常见的例子就是在革兰氏阴性菌中由质粒携带的Qnr家族蛋白.由于Qnr存在于质粒上,因此该蛋白对于环境中氟喹诺酮耐药性的传播起着重要作用.Qnr蛋白是一种五肽重复蛋白,其通过与DNA促旋酶结合而抑制氟喹诺酮-DNA促旋酶复合物的形成[43],也有研究认为Qnr蛋白可以增加细菌的突变率从而提升细菌的耐药性[44].目前已发现上百种Qnr蛋白,分枝杆菌中也存在Qnr的同源蛋白MfpA.分枝杆菌的MfpA并不是由质粒携带,而是存在于基因组上.MfpA也是通过与DNA促旋酶结合而诱发构象的改变从而抑制氟喹诺酮-DNA促旋酶复合物的形成[45].即使是抗生素已经结合在靶蛋白上,细菌也可以编码蛋白恢复靶蛋白的功能.比如夫西地酸耐受的金黄色葡萄球菌蛋白通常会表达一个FusB型蛋白.夫西地酸通过与延长因子G(EF-G)稳定结合而抑制细菌的翻译.Fusb通过锌指结构域促进夫西地酸(图3)的分离而恢复核糖体的翻译功能[46].

图3 夫西地酸的化学结构式

2.4 抗生素的灭活和修饰对抗生素灭活或修饰是细菌中广泛存在的一种耐药机制.相对于其他耐药机制,此机制最大的优势是不涉及细菌细胞功能的改变,因此一般不会产生适合度代价(fitness cost).抗生素的修饰可以分为2种机制,一种是直接降解抗生素,另一种是将抗生素的化学基团转移.

细菌通过编码蛋白破坏或降解抗生素的结构是抗生素失活的主要机制[47].抗生素失活的代表性例子就是β-内酰胺酶对β-内酰胺类抗生素的水解.β-内酰胺酶是一种由细菌编码的酶,它通过水解β-内酰胺环的酰胺键,从而降解抗生素.自20世纪40年代以来,β-内酰胺酶的数量在不断增加,目前在NCBI的蛋白数据库上已经记录了超过7 000种不同的β-内酰胺酶[48].另一个重要例子是由四环素失活酶催化四环类抗生素的氧化,其中最著名的是Tet(X)蛋白家族.Tet(X)蛋白家族常见于来自不同环境中的耐多药细菌,这表明它可以在不同种类的细菌中广泛传播.此外,临床分离株中Tet(X)的比例与四环素的使用呈正相关[49].

细菌也可通过抗生素修饰酶将抗生素的化学基团转移而导致抗生素失效.比如利福平可以被ADP核糖基转移酶、糖基转移酶、磷酸转移酶和单加氧酶修饰.脓肿分枝杆菌中的ADP核糖基转移酶是造成其对利福平耐药的原因之一[50].ADP核糖基转移酶催化ADP核糖与利福平C23的羟基相连,从而阻断其与RNA聚合酶的相互作用[51].糖基转移酶与ADP核糖基转移酶的功能类似,也是将利福平C23的羟基糖基化而发挥作用[52].磷酸转移酶通过作用于利福平的C21将其转化为无活性的磷酸利福平[53],利福平的萘基也会被单加氧酶氧合而失去与RpoB结合的能力[54].

2.5 避开抗生素靶向的代谢途径避开抗生素靶向的代谢途径也是细菌对抗抗生素的一个重要策略.细菌可以通过获得新基因来替代抗生素靶向的途径.甲氧西林是一种通过与PBP结合并抑制转肽酶活性,最终导致细胞壁合成中断的抗生素[55].MRSA中存在与PBP同源但甲氧西林亲和力较低的PBP2a.当甲氧西林与PBP2a结合时,由于PBP2a仍具有转肽酶活性,因此细胞壁的合成并不受到抑制.由于PBP2a并不具有转糖苷酶结构域,因此还需要原生的PBP发挥作用[56].通过这种靶点旁路机制,金黄色葡萄球菌可以避开甲氧西林的作用,以确保细胞存活.此外,大肠杆菌还编码一种L,D-转肽酶YcbB,可以绕过D,D-转肽酶PBPs的作用而导致细菌对β-内酰胺抗生素耐受[57].但是,YcbB还需要(p)ppGpp、PBP5和PBP1b的协同才能发挥作用,因此这一现象在耐药菌株中并不常见[58].甲氧苄啶和磺胺甲噁唑是一种常见的抗生素组合,在临床上常被用于治疗细菌引起的泌尿系统感染.这2种化合物都抑制细菌叶酸的生物合成,而叶酸是细菌合成核酸和蛋白质所必需的前物质.甲氧苄啶是二氢叶酸还原酶(DHFR)的抑制剂,而磺胺甲噁唑通过抑制二氢叶酸合成酶(DHPS).一般来说,抗生素的联合使用会降低耐药性的产生速度,但是当细菌获得额外的DHFR和DHPS等位基因时,就会产生耐药性[59].

2.6 形成生物膜生物膜是一种细菌形成的肉眼可见的异质细胞聚集体,细菌分泌的多糖蛋白、脂蛋白、多糖基质、纤维蛋白等多糖蛋白复合物是生物膜的主要成分.在临床上,尤其是在由细菌引起的慢性疾病中,生物膜是导致这些疾病难以根治的主要原因之一.生物膜的形成一般由群体感应调控.群体感应系统是一种细菌间的通信系统,当细菌生长的密度超过某个阈值时,群体感应系统能感应信号分子的浓度变化而影响特定基因的表达.它可以调控细菌代谢,促进生物膜形成以及影响细菌毒力等[60].生物膜的耐药机制相对复杂,目前一般有4种解释:生物膜形成后可以阻碍抗生素渗透;生物膜内的细菌密度高,有利于抗性基因的传递;生物膜形成后会上调耐药基因的表达;生物膜内的细菌生长几乎停滞,因此对抗生素极不敏感[61].

为了应对生物膜引起的抗生素耐药,目前在临床上也有应对生物膜的治疗手段,使用吲哚类化合物作为佐剂辅助抗生素治疗是一种应对生物膜的常规手段.吲哚(图4)作为一种信号分子,可以调节细菌的细胞分裂、生物膜形成、孢子形成和抗生素耐受性等多种生物学功能[62].比如,吲哚类化合物GW5074(图4)通过抑制c-di-AMP的合成下调金黄色葡萄球菌的Agr群感系统,最终导致万古霉素能有效杀死生物膜内的细菌[63].此外,研究发现分离自Notopterygiumincisum的镰叶芹二醇(图4)可以通过靶向铜绿假单胞菌的群感系统抑制生物膜的形成[64].除了靶向群体抑制生物膜形成以外,部分抗生素佐剂也能通过靶向c-di-GMP破坏已经形成的生物膜发挥作用.作为一种信号分子,c-di-GMP含量对细菌生物膜的形成起着至关重要的作用[65].肉桂醛(图4)是一种最常见的通过影响细菌c-di-GMP的含量破坏生物膜形成的化合物.肉桂醛通过影响LasB、RhlA和PqsA的活性而破坏铜绿假单胞菌的生物膜[66].肉桂醛也能通过改变c-di-GMP的水平破坏泌尿道致病性大肠杆菌、MRSA、粪肠球菌的生物膜[67-69].

图4 靶向生物膜的常见化合物结构式

3 新抗感染措施

抗生素耐药性是目前全球面临的最大健康威胁之一.据WHO统计,每年因耐药菌感染导致的死亡人数已经超过130万,预计到2050年每年有超过1 000万人死于抗生素耐药菌感染,直接经济损失将达10万亿美元[70].因此,亟需开发新的抗感染措施来缓解抗生素危机.噬菌体是能感染和杀死细菌的病毒,在20世纪前噬菌体已被用于治疗细菌感染,但是随着抗生素的成功使用,噬菌体的临床应用已经陷入停滞.抗生素耐药使噬菌体疗法重受关注(图5).

图5 1999年后噬菌体临床试验数目[71]

3.1 噬菌体噬菌体是细菌病毒.噬菌体感染的发生是由尾部末端附着在细菌细胞壁上,并将基因组从衣壳通过细胞膜注入细胞质起始,蛋白质衣壳和尾部留于细胞外[71].噬菌体可分为裂解性噬菌体和溶源性噬菌体.在感染后,裂解性噬菌体遵循一个单一的发育进程,包括早期噬菌体基因表达、基因组复制,晚期裂解病毒粒子结构和组装基因的表达、组装完整包装的颗粒,最后裂解细菌.溶源性噬菌体也可以遵循这种裂解生长模式,但在感染早期就会做出“决定”,即进行裂解生长或建立溶原[72].

3.2 噬菌体疗法概述在20世纪早期,噬菌体疗法提供了治疗细菌感染的第一个可行的解决方案[73].然而,抗生素的发现及其在20世纪40年代及以后的广泛使用证明其是一种更强大、更有效的抗菌解决方案,此时的噬菌体疗法的探索陷入低迷期.由于d’Herrelle在格鲁吉亚第比利斯率先开展的工作,噬菌体治疗在20世纪中期在苏联继续进行.进入21世纪后,随着抗生素的不合理使用导致耐药细菌不断增加,新型抗生素开发成本昂贵、周期长、利润低,使得噬菌体治疗又引起关注[74].

目前有多个噬菌体成功治疗多重耐药细菌感染的案例[75].比如,2019年Hatfull团队使用噬菌体成功治疗了耐药脓肿分枝杆菌引起的皮肤感染[76],2022使用噬菌体成功治疗了耐药脓肿分枝杆菌引发的肺部感染[77].噬菌体固有的理化性质使得噬菌体能够到达抗生素不能到达的感染部位.噬菌体的其他特性,如强杀菌活性和低固有毒性,也使噬菌体疗法优于传统抗生素[78].噬菌体具有高度的特异性和选择性,通常只感染有限范围的细菌.噬菌体的这种靶向性使患者正常的微生物群保持完整,这是作为治疗药物的主要优势之一,对于免疫功能低下的患者以及有基础疾病或对化学疗法过敏的患者尤其重要[79].

早期的病例系列研究描述了在多种解剖部位使用噬菌体单独或联合抗生素治疗感染[80].虽然在一部分患者中取得了治疗的成功,但是与最近的噬菌体疗法对比有2个特点.首先,在这一早期阶段,噬菌体产生技术要求大多数疗程通过口服、局部、膀胱内、直肠内或吸入途径给药.其次,噬菌体通常作为未完全确定特征的噬菌体混合物使用,这些噬菌体对所治疗的特定微生物的活性未进行体外评估.尽管近年来噬菌体敏感性检测领域取得了实质性进展,但检测方法尚未完全系统化,而且它们对临床活性的预测价值还需要大量额外的评估.此外,噬菌体制剂在显著减少农业、水产养殖、畜牧业和兽医学中的抗生素使用方面也有巨大潜力,但也需要更多的数据来标准化其使用方法[81].

3.3 抗毒力治疗策略除了通过抗生素、噬菌体等直接杀死耐药细菌外,通过靶向细菌毒力因子的治疗策略也正在引起人们的关注.与传统的治疗手段不同的是,抗毒力因子并不会直接杀死细菌,而是通过靶向细菌的毒力因子以达到减弱或剥夺细菌毒力的作用.以金黄色葡萄球菌为例,只要与细菌毒力相关的基因,都能成为抗毒力治疗的开发靶点.比如,金葡菌分泌α-毒素,该毒素通过与真核细胞的ADAM10结合后,在细胞上形成孔洞而裂解细胞.黄芩苷(baicalin)是一种从中国草药中分离的黄酮类化合物,可以通过抑制α-毒素的活性而治疗细菌感染[82].除了小分子化合物外,特异性的抗体也能抑制细菌的毒力.LC10是一种α-毒素的特异性抗体,当其与抗生素联用时可以增加金黄色葡萄球菌感染后小鼠的存活率[83].此外,调控细菌毒力分泌的基因也可以作为药物治疗的靶点.比如,金黄色葡萄球菌的SaeR是调控细菌毒力因子分泌的转录因子,分泌自甘草的天然产物甘草次酸(Glycyrrhize glabra,GRA)通过抑制SaeR的功能而减弱细菌的毒性[84].同样地,金黄色葡萄球菌的II型脂肪酸合成酶抑制剂AFN-1252也被证明可通过降低SaeR的表达量而减弱细菌毒性[85].综上所述,通过靶向细菌毒力因子的策略也能成为替代抗生素治疗的有效手段之一.

3.4 机器学习与新抗生素的发现围绕中心法则的基因组、转录组、蛋白质组等经典的高通量组学数据,以及新兴的代谢组学、脂质组学、糖组学等,提供了生物体复制、转录、翻译过程中的宝贵信息[86],也为新抗生素的发现带来了可能.目前大多数的抗生素是微生物的次级代谢产物或是对已有抗生素进行改良以优化杀菌效果[87],但前者发现的抗生素多为重复的,而后者只是对已有抗生素的修饰,因此细菌针对靶点的耐药机制依旧有效.此外,随着越来越多的微生物被测序,基于生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGC)的序列同源性推测蛋白产物以发现新抗生素也是一种可行的手段.但传统的预测工具无法推测新的基因序列以及发现新的具有抗菌活性的天然产物.因此,为了克服同源性模型的固有局限性,机器学习和深度学习模型也被用于推测新的BGC.比如,Hannigan等[88]利用递归神经网络架构开发了DeepBGC,它可以从细菌基因组中预测BGC.在经历了约600个阳性训练和数千个阴性训练后,DeepBGC推测的能编码抗生素活性分子的BGC都是传统规则无法鉴定的.Walker等[89]开发了一种二元分类器.该分类器通过输入BGC序列,根据BGC元素的存在与否将每个BCC转换为专家定义的向量,并使用常见的机器学习模型(随机森林、支持向量机和逻辑回归)确定给定的BGC是否与感兴趣的天然产物生物活性有关.除了根据基因预测抗生素产物外,机器学习也被用于预测小分子是否具有抗菌活性.Stokes等[90]开发了Halicin,该工具通过机器学习,成功地从ZINC15数据库中1.07亿个小分子中鉴定了8个具有抗菌活性的分子.

综上所述,基于现代机器学习发现抗生素的手段已日渐成熟.机器学习的方法可以提高发现新抗菌活性分子的速度并降低相关成本,也是解决抗生素危机的有效手段之一.