范兆涵,曹文君,高景宏,石金铭,卢耀恩,叶明,谭中科

(1.郑州大学第一附属医院 a.互联网医疗系统与应用国家工程实验室;b.新生儿重症监护室,河南 郑州 450052)

自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一组异质性的神经发育障碍,表现为社会交往障碍、沟通障碍以及限制性、重复性、刻板性的行为[1]。目前全球总体发病率约为1%,且以男性为主[2]。既往文献中对ASD的病因进行广泛的研究,但具体机制仍不十分清楚[3]。在治疗方面,目前研究主要是针对如自残、攻击性、重复和刻板行为、注意力不集中等体征的对症治疗,尚无治疗ASD的有效药物[3-4]。

铜是一种生命中必不可少的金属微量元素[5],在细胞中,铜通过稳态调节机制维持正常水平,防止过量引起细胞毒性损伤[6-7]。关于铜离子对细胞的影响,最近Tsvetkov等[7]提出一种新的细胞死亡方式-铜死亡,其机制主要是铜离子直接与三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环途径中的脂质酰化组分结合,导致脂质酰化蛋白异常聚集和铁硫簇蛋白丢失,导致蛋白毒性应激,最终导致细胞死亡。

铜对于神经系统的影响十分重要,铜含量失调可导致认知和运动发育异常,例如ASD[8]。ASD患者体内可观察到异常的代谢产物,TCA循环异常可能是影响综合征和散发性神经发育障碍的常见途径[9]。因此,通过药物抑制神经元铜死亡的发生可能为ASD的治疗提供新的思路。同时,铜也是免疫系统所必需的关键微量元素,免疫系统需要铜来执行多种功能,包括调节先天性免疫细胞的激活,影响组织中免疫细胞的分布等[10-11],因此铜对免疫反应的影响也不容忽视。

炎症、细胞因子在内的免疫系统、免疫功能的失调,是ASD发生不可或缺的因素[12]。其中,免疫分为固有免疫和适应性免疫,固有免疫细胞,例如单核细胞、小胶质细胞均参与ASD的发生[13-14]。适应性免疫中,T细胞等也参与ASD的发生[15]。除免疫细胞外,白细胞介素(interleukin-6,IL-6)等细胞因子失调也是ASD发生的危险因素[12]。尽管对免疫方面研究较多,但ASD免疫细胞、免疫功能之间相关程度,以及在ASD进展中的作用,仍有待完善。

精准医疗以个体化医疗为基础,分为精准预防和精准治疗,可以根据个体特点制定预防性的干预措施预防疾病发生,或根据个体患者特点制定最佳的治疗方式[16]。精准医疗是随着基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等测序技术及生物信息学与大数据科学的交叉应用而迅速发展的新型医疗模式。

目前,越来越多的人使用高通量测序平台测定基因组、蛋白质组学等,通过大型数据集分析了解许多疾病的发病机制[17]、识别疾病的潜在新生物学标志物、协助诊断和治疗[18-19]。列线图是一种将回归分析、生存分析等统计模型结果可视化的工具,通过水平线、刻度线、标度等元素使预测模型中预测因子与结局的关系图形化,直观地表达每个预测因子预测结局的作用大小,便于临床使用者对模型的理解,同时根据自变量取值简便快速估计临床结局发生概率[20]。目前被广泛应用于各个系统疾病诊疗及预后预测,为临床决策提供理论依据[20-22]。

本文利用生物信息学方法对ASD进行研究,筛选铜死亡相关基因、计算免疫浸润情况、构建免疫相关预测模型、预测可能有效的药物分子。本研究将为ASD铜死亡机制提供新的见解、潜在的生物学标志物及可能的治疗药物,并根据每个患者的个体化特征预测疾病发生概率,促进精准医学发展。

1 材料和方法

1.1 原始数据采集

从NCBI基因表达综合数据库(GEO;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)搜索2012—2022年ASD相关测序数据集,其中符合要求的为GSE18123、GSE29691。其中,GSE18123包含115个非ASD样本,170个ASD样本;GSE29691包含13个非ASD样本和2个ASD样本。GSE18123分别使用GPL6244,(HuGene-1_0-st)Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array[transcript (gene) version]和GPL570,(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 2个进行平台检测。GSE29691使用GPL570,(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平台检测。两个数据集均为基因表达阵列。本研究使用R 4.2.2版本及其对应安装包对数据进行分析。

1.2 铜死亡相关基因的数据处理和鉴定

对两个数据集使用affy进行预处理,包括背景校准、归一化、log2变换[23]。当多个探针对应于一个共同的基因时,取其平均值作为其表达值,并使用SVA软件包去除数据集合之间的批次效应。对两个数据集进行合并后与铜死亡相关基因取交集。其中,铜死亡相关基因包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS,来源于发现铜死亡的Tsvetkov团队报道[7]。

1.3 免疫细胞浸润分析

本研究使用“GSVA”软件包进行ssGSEA算法计算免疫评分,估算样本的免疫浸润程度;使用“pheatmap”软件包绘制热图;“corrplot”软件包对其进行免疫细胞、免疫功能之间的相关性分析,并绘制热图;“ggpubr”软件包采取秩和检验比较ASD组和非ASD组免疫细胞及免疫功能的差异性,并绘制箱图。

1.4 构建预测模型

使用“psych”软件包分析铜死亡相关基因与免疫浸润的相关性分析,并绘制相关性热图,根据结果筛选出与免疫最为相关的基因。使用“rms”R语言软件包,构建nomogram风险预测图。使用C指数、ROC曲线、校准曲线等对预测模型进行检验,了解铜死亡相关基因对疾病发生的意义。

1.5 铜死亡免疫相关基因进行KEGG、GO分析及潜在治疗药物预测

Enrichr网站(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)是一个基于网页端的综合性基因集富集分析工具。本研究使用Enrichr网站对铜死亡免疫相关基因进行KEEG分析,分析其可能的代谢通路;从生物学过程(biological Process,BP)、细胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3个方面进行GO分析;对ASD铜死亡基因相关的小分子药物进行预测。以P<0.05作为筛选标准。

2 结果

2.1 筛选铜死亡相关基因

将GSE18123、GSE29691两个集合数据进行处理后合并,和铜死亡相关基因取交集。发现12个ASD铜死亡相关基因:SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS。

2.2 免疫细胞浸润分析

2.2.1免疫浸润情况

本研究首先采用ssGSEA算法计算免疫评分。图1A为ASD与非ASD免疫浸润的热图。

A为免疫浸润的热图;B为免疫细胞之间的相关性分析热图;C为免疫功能之间的相关性分析热图;D为ASD与非ASD免疫细胞浸润差异性分析的箱型图;E为ASD与非ASD免疫功能浸润差异性分析的箱形图;*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001。

2.2.2免疫功能、免疫细胞间相关性分析

本研究分析ASD中浸润的免疫细胞、免疫功能的相关性,发现不同免疫细胞、免疫功能之间存在协同或竞争作用(图1B、C)。其中,CD8+T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞协同作用较强(r=0.69),而Treg细胞和树突状细胞具有较强的竞争效应(r=-0.71)。在免疫功能方面,副炎症和Ⅰ型干扰素反应具有较强的协同作用(r=0.83)。

2.2.3ASD与非ASD组免疫评分差异性分析

ASD和非ASD组免疫细胞和免疫功能的评分差异分析如图1D、E所示。部分免疫细胞不同组间差异有统计学意义,免疫细胞浸润差异的柱状图显示在ASD组中性粒细胞、肥大细胞、Treg细胞其浸润程度较高,B细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、T滤泡辅助细胞、Th2细胞浸润程度较低。在免疫功能方面,与非ASD组相比,ASD组趋化因子受体、免疫检查点、人类白细胞抗原等免疫功能减弱。

2.3 构建预测模型

对ASD铜死亡相关基因与免疫浸润的相关性分析(图2A),选出与免疫相关的基因SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS。使用上述基因构建列线图(图2B)。计算模型C指数为0.65,计算模型ROC曲线下面积为0.65(图2C),提示模型对ASD的发生风险具有不错的预测能力。绘制校准曲线(图2D),显示模型的结果与实际结果的一致性较好。

A为ASD铜死亡基因免疫浸润的相关性分析热图;B为ASD的列线图,选取免疫相关基因SLC31A1、PDHB、PDHA1、LIPT1、ATP7A、ATP7B、DBT、DLAT、DLD、DLST、FDX1、LIAS构建风险预测模型;C为预测模型的ROC曲线,该模型的ROC曲线下面积为0.652;D为列线图的校准曲线。

2.4 铜死亡免疫相关基因的KEGG、GO分析及药物预测

这些基因主要参与丙酮酸乙酰辅酶A生物合成过程、乙酰辅酶A生物合成过程、丙酮酸代谢过程等生物过程(图3A);主要细胞成分位于线粒体基质、细胞内细胞器腔等部位(图3B);主要分子功能涉及过渡金属离子跨膜转运活性、氧化还原酶活性等(图3C)。KEEG信号通路分析表明,这些基因主要参与TCA循环、丙酮酸代谢等信号通路(图3D)。利用基于DSigDB数据库的Enrichr平台对ASD铜死亡12个基因相关的小分子药物进行预测,最终提取出前10个潜在化合物(图3E)。结果显示,维A酸是与大多数基因相互作用的药物分子。

A为ASD铜死亡相关基因的BP分析;B为ASD铜死亡相关基因的CC分析;C为ASD铜死亡基因的MF分析;D为ASD铜死亡基因的KEEG分析;E为ASD铜死亡基因相关的药物预测。

3 讨论

精准医疗相较于传统治疗和预防策略,可以根据每个患者的特点制定最适合、有效的治疗和预防策略,而基因组学和生物信息学的最新进展有助于精准医学更好实现[24]。本文利用生物信息学方法对ASD铜死亡进行研究,构建ASD免疫相关预测模型,预测个体发生ASD概率,促进精准医学的发展。同时确定铜死亡相关基因组KEEG通路、GO通路、药物等,为ASD铜死亡机制提供新的思路。

ASD是一种严重的神经系统发育障碍疾病,迄今为止,无药物可以根治ASD,但目前针对各个神经系统递质,如催产素、胆碱能和谷氨酸能等的药物研究正在持续进展中[4]。

本研究发现,铜死亡基因与免疫相关性较好,且铜死亡基因对ASD的诊断具有一定的积极意义,因此,本研究认为铜死亡在ASD中可能具有一定的潜在作用。以往的研究发现,铜离子对于维持正常的神经元功能至关重要[12,25],这也提示了抑制铜死亡联合免疫治疗或可能是ASD患者治疗的新思路。

在GSE18123和GSE29691两个数据集中共选取172个ASD样本和128个非ASD样本,在样本中筛选出12个与铜死亡免疫相关的基因,包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、FDX1、DLST、DLAT、LIPT1、LIAS、DLD、ATP7A、ATP7B、DBT。其中,SLC31A1可以编码细胞膜中高亲和力的铜转运蛋白,影响膳食铜摄取[26]。PDHB是一种双功能磷酸蛋白,与病原体附着在宿主细胞表面一起在代谢途径中起着至关重要的作用[27]。PDHA1是丙酮酸脱氢酶复合物的关键成分,参与线粒体氧化磷酸化和TCA循环等过程,在葡萄糖代谢中必不可少[28]。FDX1是铜死亡的关节调控因子,蛋白质脂酰化的上游调节因子,影响线粒体代谢功能[29]。DLST、DLAT是编码线粒体蛋白质脂酰化的2个重要基因,LIPT1、LIAS和DLD是编码线粒体硫辛酸途径的3个重要基因[7]。ATP7A、ATP7B分别为铜转运蛋白ATP酶铜转运α和ATP酶铜转运β,对于哺乳动物中枢神经系统的正常功能至关重要,发生突变后可导致神经遗传疾病[30]。DBT调节支链氨基酸的降解,是线粒体多酶支链α-酮酸脱氢酶复合体的转酰基酶组分[31]。

KEEG信号通路分析显示,这些基因主要参与了TCA循环、丙酮酸代谢等信号通路等,TCA循环及其酶组分在基底细胞代谢中起至关重要的作用。根据基因构建列线图并预测小分子治疗药物,结果显示维A酸是与大多数基因相互作用、可能有效的药物分子。

4 结论

本研究确定了参与ASD免疫过程的铜死亡相关基因,制定ASD铜死亡免疫相关诊断预测模型、药物预测,根据不同患者的特点预测患病风险及可能有效药物,促进精准医学发展。同时,为铜死亡在ASD免疫方面的基础研究提供一定的思路和线索,可能有助于基于铜死亡发病机制的ASD免疫疗法的研究。