焦烨磊，陈慧聪，黄旭雄,2,3，王伟隆

（1.上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2.上海海洋大学农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心，上海 201306；3.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306）

类胡萝卜素（carotenoids）是含40 个碳的类异戊烯聚合物一类天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中。类胡萝卜素可分为两类：碳氢型的胡萝卜素类-Carotenes 和氧化型的叶黄素类-Xanthophylls，前者只由碳、氢组成，主要代表为β-胡萝卜素，后者由碳、氢、氧组成，主要代表为虾青素、虾黄素、叶黄素和角黄素[1,2]。迄今为止，从自然界中鉴定出的类胡萝卜素约有750 多种[2]，主要由各种光合细菌、植物、藻类及部分真菌合成。动物不能从头合成类胡萝卜素，可从食物中吸收和代谢类胡萝卜素[3]。微藻中主要存在β-胡萝卜素—海胆酮—角黄素—虾青素和β-胡萝卜素—玉米黄质—虾青素2 条虾青素合成途径[4]；Tanaka 等[5]提出甲壳类动物体内存在两条类胡萝卜素代谢途径，一是β-胡萝卜素—异黄素—海胆酮—角黄素—红黄素—虾青素，二是玉米黄质—4-酮玉米黄质—虾青素；Franz-Christian 等[6]提出，在加利福尼亚卤虫和加拿大卤虫体内可能存在两种不同的酮基类胡萝卜素代谢路径，前者可将β-胡萝卜素代谢为海胆酮和角黄素，而后者除海胆酮及角黄素外还可以代谢产生虾青素。类胡萝卜素是体内维生素A 的主要来源，具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老等功效[7]。类胡萝卜素在水产中的主要应用主要是着色和抗氧化能力。为了维持或增强体色、提高机体免疫力、改善健康状况，通常在饲料中添加类胡萝卜素，是一类重要的功能性饲料添加剂。类胡萝卜素中的β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素等常用于水产动物的着色和增强机体抗氧化能力[8]。卤虫无节幼体是鱼虾幼体重要的活饵料，广泛应用于水产动物苗种生产中，其营养价值影响育苗的成败。已有的研究表明，不同产地甚至是同一产地不同季节卤虫体内营养物质含量与组成也存在显著差异[9]。有关卤虫营养研究大多聚焦于卤虫体内高不饱和脂肪酸[10]，而对于卤虫体内类胡萝卜素的蓄积和代谢的研究鲜有报道，对于卤虫体内是否存在虾青素及能否代谢产生虾青素也尚未明确。

本文超高效液相色谱（UPLC）检测方法，调查了我国三产地卤虫卵及无节幼体体内涉及甲壳类动物类胡萝卜素代谢途径的5 种重要类胡萝卜素的含量，为后续探究卤虫类胡萝卜素代谢及调控卤虫类胡萝卜素营养积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用三种卤虫休眠卵的原产地分别为青海盐湖、内蒙古盐湖及渤海湾盐场，购自山东滨州前华水产有限公司。三产地卤虫卵分别在淡水中吸涨1 h 后，参照Lim 等[11]方法用次氯酸钠溶液去壳，收集去壳卵。脱氯处理后收集洗净的去壳卵，冷冻干燥后用于类胡萝卜素分析。另取三产地卤虫卵分别在25 L 盐度25 的人工海水孵化桶内孵化24 h 后分离无节幼体用于后续试验，孵化水温27 ℃～28 ℃，连续光照并充气。

1.2 卤虫无节幼体的饥饿实验

将孵化的三产地初孵无节幼体分别转移到过滤人工海水中，暂养密度为25～30 ind./mL，在盐度25、水温27 ℃～28 ℃下进行饥饿试验。试验期间连续充气，每隔12 h 换1/3 的水。在试验开始后0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 定时收集部分活的无节幼体，漂洗后冷冻干燥用于测定。

1.3 卤虫类胡萝卜素含量检测方法构建及卤虫类胡萝卜素含量测定

从德国Sigma 公司购买5 种类胡萝卜素标准品：虾青素（纯度≥97%）、玉米黄质（纯度≥95%）、角黄素（纯度≥95%；）、海胆酮（纯度≥95%）和β-胡萝卜素（纯度≥95%）标准品，用含0.1% BHT 的甲醇-乙腈（甲醇∶乙腈,v/v,3∶7）溶液定容为5 μg/mL的类胡萝卜素单一标准溶液及20.0 μg/mL、5.0 μg/mL、2.0 μg/mL、1.0 μg/mL 和0.2 μg/mL 的5 个浓度的类胡萝卜素混合标准溶液，经0.22 μm 亲水滤膜过滤至进样瓶中备检。以超高效液相色谱仪（带ACQ-QSM 型四元泵、ACQ-FTN 型自动进样器和ACQ-PDA 检测器，美国Waters）为分析平台，选用ACQUITY UPLCBEH C18 1.7 μm（2.1 mm×150 mm Column）色谱柱，通过调节流动相比例及流速等参数，获得能有效分离5 种色素的色谱条件。

称取冻干卤虫样品100.0 mg 于10 mL 离心管中，加入3 mL 丙酮∶甲醇（v/v，2∶1）溶液，涡旋震荡混匀，然后在24 Hz 下冰浴超声波处理30 min、65 ℃浸提20 min，4 000 r/min 离心10 min，收集上清液于新的离心管中，整个提取步骤重复三次。合并上清液后用氮气吹干，用3 mL 乙腈-甲醇溶液（70∶30，v/v）复溶，经0.22 μm 亲水滤膜过滤至进样瓶中备检。在构建的可有效分离5 种色素的色谱条件下检测样品中的色素组成及含量。

单个卤虫无节幼体（去壳卵）重量的测定：将含卤虫无节幼体（去壳卵）的水体装入1 000 mL 量筒，从底部充气使无节幼体或去壳卵均匀分布，用移液枪移取0.5 mL 于浮游生物计数板上，经鲁哥试剂固定后在解剖镜下计数，重复4 次。测得1 000 mL 水体中卤虫无节幼体（去壳卵）的数量。将1 000 mL 水体中的卤虫无节幼体（去壳卵）滤出，收集于10 mL离心管中，冷冻干燥至恒重，设3 个平行，计算每万只卤虫无节幼体（去壳卵）的质量。

1.4 数据统计与分析

试验结果用平均值±标准误（Mean±SE）表示，数据采用SPSS22.0 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan’s 法进行多重比较检验，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果及分析

2.1 超高效液相色谱（UPLC）检测卤虫类胡萝卜素含量方法

在超高效液相色谱仪上，通过调解流动相比例及流速等参数，获得能高效分离5 种类胡萝卜素的色谱条件：初始流动相为：10%水+90%甲醇-乙腈溶液（v/v，3∶7），于16 min 切换流动相为20%叔丁基甲基醚溶液+80%甲醇-乙腈溶液（v/v，3∶7），流速0.30 mL/min，柱温25℃，进样体积10 μL，检测波长为475 nm。在此色谱条件下，5 种类胡萝卜素的分离效果如图1 所示。β-胡萝卜素的检测限为0.05 μg/mL，其余4 种类胡萝卜素的检测限为0.02 μg/mL。在色素浓度为0～20 μg/mL 范围内，各色素浓度和峰面积呈现很好的线性关系（表1）。同一批次的卤虫样品，加入3 个不同浓度水平的标准溶液，每个加标水平测定6 次，加标回收率和精密度见表2。由表2 可知，本方法的回收率好，精密度高。

表1 5 种类胡萝卜素UPLC 法检测的线性方程、相关系数和检出限Tab.1 Linear equation,correlation coefficient and detection limit of 5 carotenoids with UPLC detection

表2 方法的回收率和精密度（n=6）Tab.2 Recoveries and relative standard deviations（n=6）of the method

图1 超高效液相色谱获得的5 种类胡萝卜素的出峰效果Fig.1 Peak curves of five carotenoids on UPLC

2.2 三产地卤虫去壳卵及初孵无节幼体类胡萝卜素含量的比较

在三产地卤虫去壳卵及初孵无节幼体内均未检测到β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素，但都能检测到角黄素和海胆酮，且无节幼体角黄素含量有所升高（表3）。渤海湾产卤虫去壳卵内角黄素和海胆酮含量显著高于青海卤虫，但与内蒙古产卤虫无显著差异（P＜0.05）。内蒙古产卤虫初孵无节幼体角黄素含量最高，青海卤虫初孵无节幼体角黄素含量最低；而青海产卤虫初孵无节幼体海胆酮含量最高，内蒙古产卤虫初孵无节幼体海胆酮含量最低。

表3 三产地卤虫去壳卵及初孵无节幼体中类胡萝卜素含量（μg/万只）的比较Tab.3 Comparisons of carotenoids contents（μg/104 ind.）in decapsulated cyst and newly hatched nauplii of brine shrimp from three different regions

2.3 三产地卤虫初孵无节幼体饥饿过程中类胡萝卜素含量的变化

随着饥饿时间的延长，三产地卤虫初孵无节幼体体内角黄素含量均逐渐降低。青海产卤虫无节幼体角黄素消耗速率和消耗量小于内蒙古和渤海湾产的卤虫无节幼体（图2）。

图2 三产地卤虫无节幼体饥饿过程中角黄素含量（μg/万只）的变化Fig.2 The variations in canthaxanthin contents（μg/104 ind.）in brine shrimp nauplii from three locations during 48 h starvation

三产地卤虫无节幼体体内海胆酮含量随饥饿时间的延长逐渐降低，饥饿24 h 后，内蒙古和青海产卤虫无节幼体体内海胆酮含量趋于稳定，渤海湾卤虫无节幼体在饥饿48 h 过程中海胆酮含量逐渐降低（图3）。

图3 三产地卤虫无节幼体饥饿过程中海胆酮含量（μg/万只）的变化Fig.3 The variations in echinenone contents（μg/104 ind.）in brine shrimp nauplii from three locations during 48 h starvation

3 讨论

甲壳类动物体内的类胡萝卜素主要是酮基类胡萝卜素，比如虾青素、角黄素和海胆酮，它们以游离态及酯-蛋白质混合物的存在形式[12]。有关虾蟹、枝角类等甲壳动物的类胡萝卜素研究较多。对虾外骨骼中沉积的主要类胡萝卜素是虾青素、虾青素酯和β-胡萝卜素[13]，且饲料中的虾青素、β-胡萝卜素和角黄素主要是以虾青素酯的形式沉积在对虾体内[14]。对韩氏溪蟹（Potamon dehaan）的研究发现，类胡萝卜素在蟹体内的分布具有组织特异性。蟹壳和卵巢中发现的类胡萝卜素主要为叶黄素和虾青素，而肝胰腺中主要为叶黄素和β-胡萝卜素，还存在少量的3′-表叶黄素、玉米黄质、蝶刺桐酮、α-皮黄素、二羟基胡罗卜酮、毛茛黄素和新黄质[15]。其他浅海生活的底栖甲壳动物通常会在组织中沉积叶黄素、玉米黄质、新黄质、毛茛黄素等一种或多种植物色素[16-19]。Glyphyocrangon vicaria、Munidopsis albatrossae 等深海底栖甲壳动物中存在异隐黄质、异玉米黄质、甲壳黄素等色素[17]。端足类（Amphipoda）等小型食草甲壳动物含有包括虾青素在内的大量类胡萝卜素[18]。卤虫体内类胡萝卜素的研究相对较少，但对卤虫类胡萝卜素的组成有不同观点。Gilchrist 等[19]在用面包酵母喂养的卤虫体内发现了虾青素酯。Hsu 等[20]在加利福尼亚湾的卤虫卵以及初孵无节幼体只检测出了角黄素和海胆酮。本研究中，对内蒙古、青海和渤海湾三个产地的卤虫去壳卵和无节幼体的检测中也均只检测到角黄素和海胆酮两种类胡萝卜素，未检测出β-胡萝卜素、玉米黄质以及虾青素。这一结果与Hsu 等[20]的结果相一致，说明卤虫胚胎和早期内源性营养阶段只存在角黄素和海胆酮两种类胡萝卜素。然而，Gilchrist等[20]研究发现，给卤虫投喂富含β-胡萝卜素的杜氏盐藻（Dunalielia salina），在成虫体内发现了酯化虾青素。白岩研究认为，卤虫摄食冰凉花后，冰凉花中的虾青素酯可以转化为虾青素单体并在卤虫体内积累[21]。表明卤虫体内类胡萝卜素的蓄积可能存在组织器官和发育阶段阶段的特异性，卵母细胞不蓄积虾青素。

本研究中，不同产地去壳卵和初孵无节幼体内检测到的类胡萝卜素含量存在差异。饵料中类胡萝卜素影响养殖动物的抗氧化能力、机体免疫力和健康状况，因此不同产地卤虫的类胡萝卜素营养价值不同。卤虫的非选择性滤食习性，通过营养强化技术可定向提高卤虫作为饵料的类胡萝卜素营养价值，即摄食外源性类胡萝卜素的卤虫体内色素的组成与饵料有关。能检测到β-胡萝卜素和虾青素的卤虫或许采自富含β-胡萝卜素及虾青素食物源的环境。三产地初孵无节幼体角黄素含量较去壳卵大幅增加，而海胆酮含量变化不显著，表明卤虫休眠卵在发育过程中可能存在一定的将其他类胡萝卜素代谢合成角黄素的能力，这还有待进一步研究。另一方面，三产地卤虫去壳卵和初孵无节幼体中类胡萝卜素总量均表现为青海产卤虫小于内蒙古和渤海湾产卤虫。这或许与三产地所处的海拔高度和纬度差异有关。青海处于青藏高原，海拔高度总体上大于内蒙古和渤海湾；而内蒙古所处的纬度又大于青海和渤海湾。通常海拔越高，紫外线辐射越强；纬度越高，紫外线辐射越弱。紫外线辐射强度会影响卤虫体内类胡萝卜素含量的变化。Kumar 等[24]发现，卤虫体内类胡萝卜素含量随着紫外线照射时间的增加而降低，未被紫外线照射的对照组类胡萝卜素含量较高，紫外线照射影响卤虫类胡萝卜素含量的原因推测与紫外线辐射可导致硫胺素-二聚体的碱基对发生变化有关[22]。

Herring 等[23]提出了淡水枝角类体内类胡萝卜素的代谢路径，淡水枝角类能将β-胡萝卜素经异隐黄素、海胆酮和角黄素这些中间产物代谢为虾青素。Katayama 等[24]认为，类胡萝卜素在日本对虾（Marsupenaeus japonicus）体内有两条代谢途径，可以将β-胡萝卜素和玉米黄质经中间产物最终转化为虾青素。卤虫体内类胡萝卜素转化代谢机制尚未完全清楚。尚没有证据表明卤虫与其他甲壳动物在类胡萝卜素的代谢转运方面存在差异。Hata 等[25]认为，卤虫应该会像其他甲壳类动物一样在性腺和卵中代谢类胡萝卜素。本研究中，饥饿过程中所有产地卤虫体内有且仅有角黄素和海胆酮两种类胡萝卜素含量发生了变化，此间也未有其他类胡萝卜素产生，表明卤虫无节幼体在不摄食的情况下无法将海胆酮或角黄素转化为其他类胡萝卜素。结合前文提到的甲壳类动物的代谢通路以及卤虫体内类胡萝卜素种类，推测卤虫可能具有类似但不完整（不能转化成虾青素）的类胡萝卜素代谢途径，不具备玉米黄质——虾青素代谢途径，其确切的代谢途径仍有待于后续营养强化试验验证。三个产地卤虫无节幼体内角黄素和海胆酮含量均随着饥饿时间的延长而逐渐降低，饥饿48 h 后发现饥饿前类胡萝卜素总量较低的青海卤虫无节幼体体内角黄素及海胆酮含量均成为三个产地中最高，表明饥饿情况下青海卤虫体内类胡萝卜素的消耗速率以及消耗量小于内蒙古和渤海湾卤虫。已知甲壳类动物贮能物质的消耗优先级与饥饿时间密切相关[26，27]，这可能是导致不同饥饿阶段类胡萝卜素消耗速率及消耗量不同的原因之一。

综上所述，三产地的去壳卵及初孵无节幼体内均不含有β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素，仅含有角黄素和海胆酮。不同产地卤虫的类胡萝卜素含量与其纬度和海拔高度有关，饥饿过程中三产地卤虫无节幼体角黄素和海胆酮的含量均随饥饿时间的延长而降低。卤虫不能合成虾青素，但可能存在β-胡萝卜素——海胆酮——角黄素的代谢通路。