何静怡,魏涯,岑剑伟,3*,李来好,杨贤庆,黄卉,郝淑贤,赵永强,王悦齐,林织

1(中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部水产品加工重点实验室,广东 广州,510300) 2(上海海洋大学 食品学院,上海,201306)3(大连工业大学,海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,辽宁 大连,116034)4(广东顺欣海洋渔业集团有限公司,广东 阳江,529800)

2021年我国渔业生产总体稳定,水产品产量达6 690.29万t,同比增长2.16%,随着人民的饮食结构的改变,水产品人均占有量比上年增加0.97 kg,上涨2.09%[1]。我国消费者对鱼类的消费习惯有别于西方,“生猛海鲜”意识根深蒂固,特别是名贵海鲜品种多以鲜活销售为主,加之我国水产品供给存在不平衡的问题,活鱼长途运输技术具有巨大的市场前景,水产品远距离、高密度、集约化保活运输及流通全过程品质和安全监控等技术难题是活鱼长途保活运输流通产业急需解决的关键技术。当前活鱼运输应激研究多集中在激素分泌、血液学分析、组织结构损伤等方面,而从鱼体代谢通路、基因表达等分子生物学角度的分析仍在发展阶段。本文归纳水质实时在线监测、低温暂养、唤醒三大鱼类活运关键技术,从转录组学、蛋白质组学、代谢组学角度总结鱼类对应激的响应机制。

1 活鱼运输方法

目前我国活鱼运输的主要对象为具有经济效益的观赏鱼类和商品成鱼类。市场上的活鱼销售种类多有地域限制。活鱼运输按距离长短可分为短途运输(≤8 h)和长途运输(>8 h)[2]。活运方式包括有水活运和无水活运两大类,有水活运是传统的活运方式,适合短途运输及名贵的观赏鱼类,但因鱼水质量比较低使得成本较高。无水活运主要有低温无水活运及模拟冬眠运输(生态冰温和麻醉辅助),无水运输大大提高了运输效率,增加运输时长。此外,利用高压使鱼体与外界环境进行气体交换的高压活运及用脉冲电麻醉进行活运[3-4],均是新型非化学的麻醉手段。

2 活鱼运输关键技术研究进展

2.1 运输水质实时监测技术

活鱼运输过程重点关注水质、溶解氧及温度条件,水质具有非线性变化、不稳定的特征,难以用传统模型精准预测水质好坏[5]。微型芯片内含可反复擦写的只读程序存储器和随机数据存储器,执行速度快、存储量大,支持多种计算机开发语言,为科研工作者及产业实际应用带来更多可能性。随着科技进步,微型芯片因可灵活自主编程在各行各业得到广泛应用[6]。卢俊杰[7]选用AT89C51微型芯片作为监测系统的主控,结合极谱型复膜式溶解氧电极传感器和集成型温度传感器,将温度和溶解氧浓度通过传感器转化为电信号后由A/D转换器转化为数字量,监控系统由数据采集分析、传感器驱动、人机界面及外围电路组成,该系统可以实时研判数据和预设数据差值,调节温度和溶解氧系统控制改善水环境,由微型芯片机驱动的自动监控系统实现了制冷保温、增氧、杀菌、水净化等功能,可实时监测水质。在实际应用中,福建省八达龙有限公司采用上述系统半年累计完成38 t 超60 h的活鱼运输,不同鱼种的运输均有极高的存活率。王新鹏等[8]提出结合无线通信和物联网技术,增加多个传感器以采集水质的温度、浊度、pH及溶解氧等多个参数,通过以太网对传感器数据进行传输,结合前后端信息交互,实现远程智能控制水质。此外,人工神经网络作为一种以神经元为基本结构单元的大规模信号处理系统,通常由输入层、隐藏层和输出层组成,模拟生物神经网络中信号输入、传递、激活过程,不断调整计算人工神经元之间的权值,将其相互连接起来,具有较强的学习能力和非线性映射能力[9-10],随人工智能进步,人工神经网络模型在污水处理、环境水质、医学、采矿等领域多有应用,谢万里等[11]基于人工神经网络的广泛适应性,创新性地通过调整权值和阈值以不断接近期望值,进而网络收敛的反向传播(back propagation,BP)网络和根据预设误差不断动态调整节点、标准差,使得样本转移到新空间以得到逼近结果的径向基函数(radial basis function, RFB),使用该神经网络应用于运输河川沙塘鳢和杂交黄颡鱼过程中的水质评估,选择溶解氧、总氨氮TAN、pH指标作为网络输入层,构建传递函数、输出层、隐含层、训练模型,实验发现2种神经网络模型的评价结果一致,表明模型建立成功,但RFB具有更高的预测精准度和客观性,计算参数更少且有更高的响应速度。在水质在线监测的发展和当前大量生物传感器仍易受生物污损而需要经常更换元件的局限性下,BOWNIK等[12]提出建立连续监测敏感水生生物指标的行为或生理参数的实时生物预警系统,基于视频动物行为追踪技术,分析动物生理行为特征,掌握水质的连续变化,该系统可检测出水质分析标准之外的微生物毒理参数等,为优化活运水质及掌握有水运输中的污染源提供新思路。随着活鱼长途运输的高速发展,传统理化实验监测及经验运输理论已经不符合现代活运要求,水质动态监测及远程控制技术在当今活鱼长途运输产业中亟待提升。

2.2 低温暂养技术

低温暂养主要是使鱼体适应运输环境、代谢排泄及对鱼冷训,常采用梯度降温和禁食操作。暂养的本质是在维持鱼类生存环境条件下适度饥饿以调节能量代谢和降低氧化应激来提高机体的抗逆能力,减少新陈代谢和耗氧量,延长保活时间,提高存活率[13]。暂养环境和方式由鱼的种类、运输方式、运输时长等决定,随着活运技术进步和应用推广,在保证运输成活率的前提下,暂养时间逐渐缩短[14]。陈亚楠等[15]研究暂养温度、氨氮浓度、暂养密度对斑点叉尾鮰的肌肉水分含量、pH和持水力三大肌肉理化性质和质构特性影响,结果表明温度和氨氮浓度越高,肌肉理化和质构特性下降越显著,暂养密度过大导致溶氧少而降低持水力,过小则因活动少也导致肌肉水分和持水力下降。李小勤等[16]在不同盐度下暂养草鱼发现盐度越高渗透耗氧量越大,草鱼损耗率越大,但合理的盐度升高可增加肌肉羟脯氨酸、胶原蛋白含量,改善草鱼口感。除控制上述水质理化因素外,陈帅等[17]采用混合式直接传热系统对暂养池水降温,设计包含机械制冷、热交换、给水和自控的温控系统,通过热工计算制冷量,将换热器、制冷机和过滤器连接一体,使得池水降温过滤循环,补充了冰块降温和自然对流等传统降温模式无法满足观赏鱼的养殖要求,该设备运用于珍珠、红狮等观赏鱼暂养中,成活率达98%以上。SHRIVASTAVA等[18]评估禁食时长对鲤鱼耗氧率、氨含量、Na+/K+ATP酶和H+ATP酶活性等的影响,实验结果表明,鱼体具有最适禁食暂养时长,适宜时长可保证清肠,在运输中不产生过多排泄物,但超过最佳时长,鱼体则不能维持自身基础代谢水平,对运输应激的抵抗力也将下降,加重应激损伤。因此,对鱼种个性化暂养条件优化的探究是保证活鱼运输的关键步骤,需全面考虑各因素之间相互联系。目前,广东省活鱼运输企业运用“低温暂养、冷链运输”技术[19-20],采用高低位暂养池设计,应用新型微孔供氧和多级过滤技术,保证供氧均匀、低温能耗低,暂养密度大,结合液氧配送,不添加任何麻醉剂,成功突破活鱼远程冷链运输时长超过50 h的技术难关,存活率高达99%以上,实现“南鱼北运”,成为了全国活鱼长途运输产业的典范。

2.3 唤醒技术

运输到达目的地后需要对活鱼进行唤醒操作,将运输后的鱼类放置于水温约为该鱼生态冰温区的暂养池中,随后梯度升温使鱼体恢复正常。唤醒需要控制的关键点是暂养池中水的初始温度和升温速率,目前多侧重于对改善活鱼暂养条件及减少运输过程中应激的研究[21],对唤醒环境的研究多体现在升温速率方面,张长峰等[22]设计了无水保活方法及工业化实现系统,在该系统应用于鲫鱼、鲤鱼等通过梯度降温使其进入半休眠或休眠期,运输后在不同温度梯度内设置升温速率对鱼进行唤醒:当温度为-2～5 ℃时,适宜的升温速率为0.8～1.5 ℃/h;当升温至5～10 ℃时,适宜的升温速率为1.5～3 ℃/h;当升温至10～30 ℃时,适宜的升温速率为3～5 ℃/h。无论何种活运方式,经过禁食暂养、保活运输后的鱼体维持基础代谢水平,理想的唤醒时长、唤醒环境是保证鱼体健康的关键,其温度耐受性和理想升温速率不同,认为对暂养环境的研究可为唤醒技术提供数据参考,监测鱼体特征,调节适宜升温速率可提高唤醒率,研究不同鱼的唤醒模式对鱼类运输亦是重要一环。

3 多组学技术在鱼类应激响应研究的应用

应激是鱼类对外界环境变化的响应,鱼体通过神经内分泌系统分泌激素调节免疫、代谢、生长等生理活动。评估应激对鱼类的影响多从生理生化、血液学、组织结构等角度展开,但应激是动态过程,和鱼体存在复杂的联系。高通量、高灵敏度的组学技术(基因组学、转录组学、蛋白质组学及代谢组学)可得到更多有效数据,多组学联用技术流程如图1所示。目前组学技术在水产养殖、污染影响、疾病诊断、食品加工领域中应用,成为了当前的主流研究技术手段[24],但从组学角度分析鱼类运输应激响应机制并基于组学技术提出改善运输环境的相关实用技术尚少,表1列举了部分基于组学技术分析鱼类常见应激的研究机制,掌握鱼体内的基因表达、代谢产物及通路的改变,为从分子生物学角度完善活鱼运输技术提供理论基础。

表1 近年来各组学技术在鱼类应激中的研究进展

3.1 转录组学分析

生物体在特定发育阶段或生理条件下细胞、组织或器官的一整套转录本称为转录组,转录组学技术是用于研究生物体转录组的技术,主要包括杂交(如微阵列)、新一代高通量RNA测序技术(RNA-sequencing, RNA-seq)和实时定量聚合酶反应(real time- quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)3种技术[36-38]。VALDÉS等[39]结合其工作原理对比上述3种技术的优缺点,可用于指导转录组学的实际应用。经技术更迭完善,微阵列及RT-qPCR技术因需特殊生物平台且水生生物基因信息覆盖少而逐渐被可以不依赖已知生物基因信息的RNA-seq所取代[40]。RNA-seq主要包括四大阶段:质量控制、基因比对、定量和差异表达。测量生物体基因在不同组织、条件或时间点的表达情况,对转录组图谱分析,包括基因表达、可变剪切、反义转录本、基因结构、基因功能新注释、GO及KEGG富集分析差异表达基因和单核苷酸多态性、等位基因特异性表达和基因融合等丰富的信息[38,41]。

CAO等[42]分析不同盐度、缺氧状态及高温胁迫下鱼体的应激状况,通过生物信息学技术及RNA-seq进行基因功能注释、GO及KEGG富集分析,发现盐度胁迫下差异基因主要富集在细胞过程、信号转导、细胞定位、细胞/离子转运、类固醇生物合成、不饱和脂肪酸及能量代谢、生物调节、免疫应答中,代谢是盐度影响最大的途径,XU等[43]基于脾脏和头肾组织的转录组学,研究长期的高盐度胁迫造成显著的免疫途径改变,降低凝血功能,脾脏肿大、增强吞噬活性并下调补体途径;CHEN等[44]对鱼体肝脏、鳃、心脏组织富集分析发现,随缺氧时间延长,合成代谢相关途径在肝脏中富集,mTOR(雷帕霉素靶蛋白)和VEGF(血管内皮生长因子)信号通路在鳃中富集,心肌细胞中的肾上腺素在心脏中富集;魏亚丽等[28]在不同高温胁迫下对尼罗罗非鱼肝脏组织分析,发现差异基因主要富集在糖酵解、细胞周期、内质网的蛋白质加工及胰岛素信号等通路上,实验表明高温胁迫下肝脏组织中参与热应激相关的基因涉及生长、蛋白质折叠及能量代谢等多个生物学过程,罗非鱼神经内分泌的调控抑制生长,高温下机体的新陈代谢和能量消耗不断增强。

对运输过程中的应激可以用于生物标记,作为生物或致病过程的指标,新一代基因测序技术对总转录本的分析揭示了发生在单个细胞或复杂群落中的过程(元转录复制)[45],分析应激对基因表达的影响,明确在不同环境中差异基因主要的富集通路不同,进而可准确分析不同应激对鱼体各组织结构的影响机制,但通过转录组学分析运输中的短期应激研究并改善活运条件的实际应用尚少,基于转录组学的鱼类应激分析多集中在慢性应激,认为转录组学对发展养殖具有抗应激性状的新鱼种具有巨大潜力。

3.2 蛋白质组学分析

转录组学只提供基因表达的理论信息,并不能解释蛋白质翻译、不能提供关于基因产物的亚细胞定位或蛋白质修饰的信息,且mRNA丰度与蛋白质水平不一定完全相关,因此蛋白质组学快速发展以完善功能基因组研究[46]。蛋白质组学技术是一项大规模、高通量、系统化研究某一个细胞、组织或生物体在特定时期所表达的全部蛋白质的技术,它是研究蛋白质组成及其变化调控规律的科学[47-48]。蛋白组学分为定性和定量研究,定性研究包括通过酶解手段降解蛋白质至肽段再倒推蛋白质信息的自下而上和直接将蛋白质打碎的自上而下的分析方法[48],图2展示了2种不同方法的分析步骤。基于质谱分析,定量研究分为靶向和非靶向定量,非靶向定量分为稳定同位素标记定量和非标记定量,标记定量包括相对和绝对定量同位素标记(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)和串联质谱标签(tandem mass tags, TMT),非标记定量采用液质联用;靶向定量技术包括多重反应检测技术和平行反应监测技术[47]。蛋白质组学主要用于研究发病机制、免疫调节及宿主病原体的相互作用,可分析监测蛋白质活性的改变并提供关于翻译后蛋白质的机械信息,通过蛋白质组学在鱼类中确定活鱼福利的生物指标[49-50]。

图2 蛋白质组学的典型工作流程:基于凝胶的自上而下和无凝胶自下而上的策略[49]

章孝颖等[29]、李明云等[51]采用TMT、双向凝胶电泳分离蛋白和液相色谱及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱结合,分别研究高温和低温胁迫下大黄鱼的肝脏蛋白组学,结果表明,热休克蛋白70、钙网蛋白和葡萄糖调节蛋白参与调节蛋白质的正确折叠,丙酮酸激酶参与高温下的能量供给,高温对蛋白质折叠、能量代谢有显著影响,高温下鱼体激活合成热应激蛋白抵抗胁迫,糖酵解通路是高温下缺氧产能的重要途径,而低温胁迫后肝脏细胞内膜转运中的ATP酶、角蛋白18和2-半胱氨酸过氧化物酶表达显著下调,肌球蛋白重链表达显著上调,表明低温抑制细胞分泌和融合,蛋白出现转运障碍导致受损细胞不能被修复使得细胞凋亡,破坏肝细胞骨架,致肝细胞最终凋亡,而过氧化物酶表达下降表明机体的抗凋亡能力下降,认为低温通过加速细胞凋亡和阻碍受损细胞及时得到修复最终导致鱼体死亡,基于此,黄智慧等[52]通过对大菱鲆急性低温胁迫提出,提高肌球蛋白轻链的表达以满足ATP酶活性需要,保证低温下鱼体对基本能量代谢需求。NUEZ-ORTN等[53]研究高温慢性应激下大西洋鲑鱼肝脏的蛋白组学,发现蛋白质降解减慢作为高温下能量不足的补偿机制,能量代谢途径的变化是为了适应高温条件下代谢率的增加,而脂质氧化是由于在高温下氧化还原反应的不平衡产生大量活性氧,在应激中抑制蛋白质的合成和降解是重要的调节机制,有必要进一步了解不同氨基酸提高肝脏解毒能力的潜力,评估成分和添加剂以补偿能量不足,改善鱼体对应激的承受能力。

肝脏作为鱼类应激过程中主要的免疫、渗透调节和蛋白质合成器官,也是蛋白组学最重要的研究对象。通过蛋白组学研究应激对鱼体的影响,可选择更适合鱼种的运输方式,蛋白质的合成和分解是机体抵抗应激最直接的方式,和细胞、酶活性、生物体直接相关,找到应激因素下相关的关键蛋白,通过蛋白组学能阐释在动态应激条件下鱼体的免疫改变,从小分子角度表明在运输应激过程中鱼体蛋白质的实际情况。

3.3 代谢组学分析

代谢组学是建立在数据处理基础上的小分子代谢分析,一般分子质量小于1 kDa,是继基因组学、转录组学、蛋白组学后的一种小分子高通量技术,目前多在鱼类饲料、重金属影响、病理学等方面展开研究[54]。代谢组学的中心任务包括检测、量化和编录内源性代谢物质的整体及其动态变化规律,确定此变化规律与生物学过程之间的有机联系[48]。实验步骤包括取样、样品制备、仪器分析、数据处理和生物学阐释,为实现改善代谢组和功能基因组相关生物信息现状的目标提出了独特的挑战[23],如图3所示为代谢组学分析流程。数据的处理有多元统计分析和模式识别法(pattern recognition, PR),PR主要包括无监督和有监督的数据分析,无监督主成分分析(principal component analysis, PCA)是代谢组学分析的第一步,在确定成分和样本的关系后,采用监督数据分析法确定样本分类及其来源的预测,包括正交最小偏二乘法回归-判别分析、偏最小二乘回归、聚类分析、显著性分析等[24]。

图3 代谢组学分析流程

LOW等[23]归纳了应用代谢组学分析鱼类受各种病毒、细菌等感染后的代谢变化,认为通过高通量技术对受感染鱼类的代谢组进行表征,可开发出病毒感染生物标志物。康玉军[48]对高温胁迫下的虹鳟肝脏展开代谢组学和蛋白组学研究,利用超高液相色谱-飞行时间/质谱非靶向代谢组学技术对慢性热应激后肝脏的代谢产物和丰度进行分析,差异代谢物显著富集到与蛋白质组消化与吸收、氨基酸代谢、氨酰-tRNA生物合成等相关的通路,表明在慢性热应激中肝脏蛋白质合成能力减弱,虹鳟体内的能量供给主要依靠赖氨酸而不是脂肪酸和葡萄糖,对其他代谢物如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等显著富集在不饱和脂肪酸代谢中,表明脂质代谢的干预或调节可能对缓解虹鳟慢性热应激有作用。LIU等[35]结合核磁共振和RNA-Seq研究典型的冷水鱼在热应激下肝脏及血浆的生理代谢变化,结果表明,热应激导致该鱼出现能量代谢抑制、脂质、氨基酸、胆碱和核苷酸代谢的改变,诱导谷氨酸代谢激活,因此认为谷氨酸可能是该冷水鱼的代谢标志物。而WEN等[55]研究冷应激对铁饼鱼(温水性)鳃的生理反应,发现影响最大的代谢途径包括戊糖磷酸途径、淀粉和蔗糖、甘油脂和脯氨酸代谢。刘佳琳等[54]对不同盐度下的褐牙鲆幼鱼组织进行代谢组学分析,发现氮氧三甲胺是该鱼应对海洋高盐度的主要渗透调节物,及部分代谢标志物如牛磺酸,氨基酸含量的显著升高表明低盐浓度影响了蛋白质合成,应采用不同养殖策略以适应盐度胁迫,张彦坤等[34]和高淑芳等[56]分别用基于LC-MS的代谢组学技术研究饥饿胁迫14 d后剑尾鱼肝脏组织和不同盐度胁迫下刀鲚卵巢代谢产物分析,认为饥饿胁迫主要通过干扰剑尾鱼肝脏中的糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢影响其免疫、抗炎症及抗氧化能力,FoXO通路在饥饿胁迫中影响多种生物学过程,饥饿后L-精氨酸和牛磺酸显著下调表明免疫和抗氧化应激能力的下降,但肝脏中亚油酸的上调弥补了与免疫相关代谢物的减少,因此,就饥饿胁迫是否造成免疫下降需进一步确认,而不同盐度下变化显著的通路有氨酰-tRNA的生物合成和嘧啶代谢通路,认为上述2种通路改变及鞘磷脂通路的改变均与刀鲚卵发育。SUN等[57]采用高分辨率的超高液相色谱-飞行时间/质谱和化学计量分析学研究鲫鱼在碱性胁迫下应激的生物标志物和代谢机制,发现7种碱性胁迫下的标志物和23种受影响的代谢通路,表明碱性暴露导致代谢模式发生改变,其中包括氨基酸、丙酮酸的代谢破坏等,对后续培育具有耐盐碱的的鱼种鱼苗计划提供理论支持。

运用代谢组学分析应激因素对鱼类代谢产物的影响,在不同应激因素下,其显著富集的代谢通路和差异代谢物均不同,通过非靶向代谢组学找到富集代谢通路和产物,进而通过靶向鉴定各产物性质和推理应激对鱼体的影响,分析多种因素下鱼体的变化及应激响应机制,针对性培育对抗不同应激影响的鱼种并运输,目前基于代谢组学的机制研究多从非靶向角度出发,即还未确定不同鱼类在应激下代谢的规律,因此,认为有必要加大对多种鱼类的代谢组学研究以探究鱼体内的应激响应规律,通过高通量技术对应激鱼类进行靶向代谢组表征有利于推进鱼类应激响应机制的研究。

4 总结与展望

本文总结了活鱼暂养、运输水质实时监测、唤醒3种活鱼长途运输关键技术,简述不同技术的工作原理及实际应用,归纳了应用多组学技术分析各应激因素对鱼体中重要组织(如肝脏、肠、头肾、脑、鳃等)基因转录翻译、蛋白质表达情况及代谢产物变化的影响,基于高通量技术、质谱色谱联用、多元统计学等分析鱼体对应激响应机制的研究进展。目前国内外逐渐重视对不同鱼种应激响应机制的研究,通过单一组学从不同角度分析应激影响下通路及差异基因(蛋白质/代谢产物)改变,并就此提出应激研究对培育新抗应激性状鱼种的重要价值,但研究多为长期应激,针对活鱼运输中的短暂应激的研究和通过运输应激响应机制研究提出实际可行的改善方案目前尚少。通过组学研究发现更多的潜在生物标记物,对不同鱼体实现个性化、准确度更高的应激分析;培育适合运输的抗不同应激性状的新鱼种;基于组学技术分析科学暂养、饲喂以提高鱼体抗应激能力;在提高运输存活率前提下就改善活鱼口感滋味,对更多无残留运输方法的开发等多个问题均有待通过组学技术解决。通过对多组学技术的分析得到单一组学技术由于其孤立的数据不能完全揭示生物体的复杂性,因此,多组学核心平台与尖端生物信息学的结合,将深化运输鱼类应激机理的研究。在活鱼应激中,结合转录组学可阐释差异基因表达,得到更多特征生物标记物,基于蛋白质组学可反映鱼类免疫应答的机制,通过代谢组学可评估压力对鱼体的影响,有利于在动态过程中捕获更多代谢产物的变化,实时跟进鱼体生理状况,提高运输效率和鱼肉品质。

多组学技术联用分析应激因素对鱼体从基因表达到肌肉品质等多方面影响的快速检测将更快更准。我国目前组学技术仍在发展阶段,多组学技术意味着更庞大的数据库,对数据融合、存储、分析、建模等的专业要求更高,对数据的有效整合、动态分析的正确使用和解释是目前的组学技术挑战[48]。另外,组学检测设备建立于高端的质谱检测技术,这些设备、维护管理及耗材费用高昂,常规实验室难以承受。活鱼运输是动态变化过程,组学分析要求对样品的快速分析,因此在实际应用中应综合考虑精准快检和样品前处理的时效性。我国常见大宗经济鱼类的长途运输距离已覆盖全国,达到了国际领先水平。多组学联用技术从分子层阐明活鱼运输过程应激反应的机理并就此提出可行性方案将有助于我国活鱼运输产业的可持续发展,相关研究亟待开展。