庞梦迪,孙 靖,贾步云,张忠伟,杨奇奇,陈卫东,4,5,唐丽琴

(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012;2.安徽医科大学第一附属医院药学部,安徽 合肥 230022;3.安徽中医药大学中西医结合学院,安徽 合肥 230012;4.省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心,安徽 合肥 230012;5.中药复方安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;6.中国科学技术大学附属第一医院,安徽 合肥 230001)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌,是全球第三大癌症相关死亡原因［1］。目前,治疗HCC的主要手段有肿瘤病灶切除、化学治疗、放射治疗和肝移植等。由于HCC前期无典型症状,并且缺乏特异性诊断该病的生物学标志物,患者确诊时多已发展至中晚期,手术治疗的机会降低［2］。仑伐替尼是一种新型的HCC一线治疗药物,在2018年被美国食品药品监督管理局批准用于HCC的治疗［3］,已被证实可显著改善晚期HCC的无进展生存期［4］。临床试验发现,与采用索拉菲尼治疗的晚期肝癌患者比较,采用仑伐替尼治疗的晚期肝癌患者总生存期更长［5］。然而,由于原发性或适应性耐药,靶向治疗的耐药情况不容忽视,尽管仑伐替尼是晚期HCC治疗的理想靶向药物,但其治疗的总有效率只有24%,并且已有研究［6-8］报道仑伐替尼耐药病例。仑伐替尼耐药成为改善肝癌患者预后的主要障碍［2］,除了迫切需要阐明肝癌患者仑伐替尼耐药的机制外,另一个策略是寻找可能使仑伐替尼在HCC治疗中敏化的候选药物［9］。有研究［10-12］表明,临床上采用仑伐替尼联合抗程序性死亡受体1药物派姆单抗、仑伐替尼联合吉非替尼治疗HCC患者,均取得良好的治疗效果。联合用药是目前非常具有前景的肿瘤治疗策略,选用作用机制不同的两种药物联用,发挥协同作用,可提高疗效而不增加毒性,同时减少耐药现象的产生,对提高靶向药物敏感性具有重要的临床意义。

近年来,中药抗肿瘤作用在临床上应用得到重视,大量临床和实验研究表明,中药辅助治疗肿瘤是一种安全、有效的途径［13］。中医药在抗恶性肿瘤治疗领域取得了一定进展,尤其是在减毒增效、逆转肿瘤细胞的多药耐药方面,可以达到减轻毒性、增加疗效的目的,从而使患者更好地完成规范化治疗［14］。藤黄是藤黄科植物藤黄的干燥树脂,具有攻毒蚀疮、破血散结等功效。新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)是从中药藤黄中分离出来的重要活性成分,现代研究［15］表明,GNA作为藤黄中的活性成分之一,具有良好的抗肿瘤活性。GNA具有多种抗癌活性,因此其作为潜在的抗癌药物,得到了越来越多的关注。课题组先前的研究［16］表明,在HepG2细胞的体外药效学实验中,无毒剂量的GNA可以通过抑制mRNA和蛋白表达而成为ATP结合转运蛋白B1(ATP-binding cassette transporter B1,ABCB1)和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate binding cassette transporter G2,ABCG2)的潜在抑制剂,其机制与下调孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达有关。课题组后续研究［17］证实,GNA在一定浓度范围内对HepG2/Adr细胞具有逆转作用,GNA可影响HepG2/Adr细胞内P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的功能和表达,增加HepG2/Adr细胞中阿霉素和紫杉醇的化学敏感性,逆转HepG2/Adr细胞的多药耐药,并促进细胞凋亡。本研究观察GNA协同仑伐替尼对肿瘤小鼠模型的药效及作用机制。

1 材料

1.1 主要仪器 十万分子一电子分析天平(AB135-S):德国梅特勒—托利多公司;超灵敏多功能成像仪(AMERSHAM TMAGER 600):美国General Electric公司;生物组织包埋机(ZT-12M):湖北亚光;显微镜(CX41):OLYMPUS。离心机(LC-4016):安徽中科中佳科学仪器有限公司;电泳仪(DYY-7C):北京市六一仪器厂。

1.2 主要试剂 GNA(纯度≥98%)由安徽中医药大学GNA课题组提供;仑伐替尼(HY10981):MCE公司;PXR抗体(DF6478):江苏亲科生物研究中心有限公司;P-gp(ab170904):艾博抗(上海)贸易有限公司;细胞色素P450 3A4酶(cytochrome P450 3A4,CYP3A4;18227-1-AP)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP;27286-1-AP)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;26593-1-Ig)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax;60267-1-Ig)、P53(60283-2-Ig)、cleaved-caspase-3(66470-2-Ig):武汉三鹰生物技术有限公司;GAPDH(批号 R24404):正宁生物;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(B014):Ebiogo公司。

1.3 动物 雄性BALB/c小鼠,体质量22～25 g,购自杭州子源实验动物科技有限公司［生产许可证号 SCXK(浙)2019-0004］。所有实验均得到安徽中医药大学动物伦理委员会的批准,动物实验伦理编号为AHUCM-mouse-2022148。小鼠常规喂养,自由饮水,温度(24.0±2.0)℃,相对湿度(55±5)%,12 h暗光周期,适应性饲养1周。

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 H22肝癌细胞在1640培养基(含10% FBS,1%青霉素链霉素)中培养,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,选取对数生长期的细胞进行实验。将细胞密度用PBS稀释为1×107/mL,将所述细胞皮下注射到小鼠右腋,每只小鼠接种0.2 mL,当肿瘤体积达到约100 mm3时,将小鼠随机分为模型组(生理盐水)、GNA(20 mg/kg)组、仑伐替尼(10 mg/kg)组、GNA(20 mg/kg)+仑伐替尼(10 mg/kg)组,每组10只。各给药组小鼠连续灌胃2周,每日1次。给药结束后将小鼠处死,收集血液、心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织。血清样本在4 ℃下,以3 000 r/min离心10 min后收集。将部分肝脏和肿瘤组织固定在10%福尔马林溶液中进行组织学分析,其余组织立即冷冻在-80 ℃冰箱以备进一步研究。

2.2 采用苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法观察H22荷瘤小鼠主要脏器病理变化 将小鼠心、肝、脾、肺、肾组织在10%甲醛中固定,进行病理检查,乙醇脱水,二甲苯清洗,石蜡包埋,切片和烘干,HE染色,并在显微镜下观察,以评估GNA和仑伐替尼对动物的安全性。其余肿瘤组织存放于-80 ℃冰箱,备用。

2.3 采用TUNEL荧光染色观察H22荷瘤小鼠肿瘤组织的凋亡 将H22荷瘤小鼠肿瘤组织切片放入干燥箱烤片,依次过二甲苯、乙醇,将切片流水冲洗干净,滴加DNase的蛋白酶K,37 ℃培养箱孵育。PBS冲洗3次。滴加TUNEL检测液,培养箱孵育。PBS冲洗后封片,数字切片扫描仪扫描荧光切片。

2.4 Western blot法检测PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2、P53、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表达水平 称取100 mg H22荷瘤小鼠的肿瘤组织,加入RIPA裂解液,冰上裂解,离心,收集上清,采用BCA试剂盒检测蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液,进行SDS-PAGE电泳分离,转膜,封闭,加入一抗GAPDH、PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2、P53、Bax、cleaved-caspase-3孵育过夜,清洗后二抗孵育2 h,超灵敏多功能曝光成像仪曝光处理,计算目的蛋白和内参蛋白灰度值之比,实验重复3次。

3 结果

3.1 GNA联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠肿瘤质量及体质量的影响 与模型组比较,仑伐替尼组、GNA+仑伐替尼组小鼠肿瘤质量显著降低(P<0.05);与仑伐替尼组比较,GNA+仑伐替尼组小鼠肿瘤质量显著降低(P<0.05)。给药前后GNA组与仑伐替尼组的小鼠体质量无明显变化(P>0.05),GNA+仑伐替尼组小鼠体质量从第7天开始显著降低(P<0.05)。结果说明GNA与仑伐替尼联用可以显著抑制荷瘤小鼠体内的肿瘤生长,且效果优于GNA单用和仑伐替尼单用。见图1。

注:A.模型组;B.GNA组;C.仑伐替尼组;D. GNA+仑伐替尼组;与模型组比较,*P<0.05;与仑伐替尼组比较,#P<0.05;与给药第1天比较,aP<0.05

3.2 GNA联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠各脏器的影响 与模型组比较,各治疗组小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)均未出现明显病变,提示药物治疗对这些脏器无不良影响;结合GNA+仑伐替尼组小鼠体质量显著下降,而其余各组小鼠体质量无明显变化,可以认为,GNA(20 mg/kg)+仑伐替尼(10 mg/kg)组的给药剂量比较安全。见图2。

3.3 GNA联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响 与模型组比较,各给药组均发生了明显的细胞凋亡;GNA+仑伐替尼组细胞凋亡较仑伐替尼组更加明显。结果提示GNA联合仑伐替尼增加小鼠异位移植瘤组织的细胞凋亡。见图3。

注:绿染的细胞即为发生凋亡的细胞

3.4 GNA联合仑伐替尼对移植瘤小鼠模型组织中PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、P53、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白表达水平的影响 与模型组比较,GNA组PXR、P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05);仑伐替尼组P-gp蛋白表达水平显著降低(P<0.05),P53、cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著上升(P<0.05);GNA+仑伐替尼组PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),P53、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。与仑伐替尼组比较,GNA+仑伐替尼组PXR、P-gp、BCRP、CYP3A4、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),Bax蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。结果说明GNA与仑伐替尼联用抑制了肿瘤组织内核受体PXR及下游代谢酶和转运体的表达,增加仑伐替尼在肿瘤组织中的蓄积,提高药效,并且调控相关凋亡蛋白,诱导肿瘤组织的细胞凋亡。见图4。

注:A.模型组;B.GNA组;C.仑伐替尼组;D.GNA+仑伐替尼组;与模型组比较,*P<0.05;与仑伐替尼组比较,#P<0.05

4 讨论

HCC是世界范围内常见的一种癌症,是一种高度血管化的肿瘤［18］。HCC的监测、诊断和管理取得了较大的进步［19］,尽管该疾病的发病率在下降,但疾病的特定死亡率仍然很高［20］。GNA是来源于中药藤黄的主要活性成分,药理学研究表明,GNA抗肿瘤活性强、抗癌谱广。仑伐替尼主要由CYP3A4代谢,并作为ATP结合盒(ABC)转运蛋白的底物,如P-gp和BCRP,分别由ABCB1和ABCG2基因编码［21-23］。P-gp、BCRP和多药耐药相关蛋白2也可能在仑伐替尼药物代谢动力学中发挥作用。PXR是核受体超家族的典型成员,PXR可以被内源性和外源性物质激活。PXR不仅在正常组织中表达,而且在多种类型的人类癌症中表达,包括骨肉瘤［24］、结肠癌［25］等。最重要的是,PXR在肿瘤组织中的表达水平通常高于非肿瘤组织。新的研究［26］还表明,PXR参与细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖、血管生成和氧化应激等过程,这些过程与癌症密切相关。有研究［27］报道,PXR参与糖脂代谢、类固醇激素稳态、胆汁酸代谢等,可通过调控代谢酶(如CYP3A)和转运体(如P-gp)的表达,来消除异源生物质和内毒素可能对机体造成的损伤。目前,尚未有研究阐明核受体与耐药现象之间的关系。本研究旨在探讨GNA通过调控PXR增强HCC对仑伐替尼的敏感性,诠释GNA协同治疗HCC的优势和机制,为仑伐替尼的联合用药提供科学依据。

研究表明,PXR与肿瘤细胞的凋亡有关,并且可能是多药耐药的重要因素。2005年,Zucchini等［28］证明了在人和大鼠肝细胞中,PXR表达对于Bcl-2和Bcl-xL上调是必需的。PXR可能通过同时调节解毒和细胞凋亡途径来保护肝脏免受有害化学物质的侵害。Yasuda等［29］研究表明,酮康唑和异硫氰酸苯乙酯通过抑制PXR调控的不同途径增强了铂类化合物的抗肿瘤活性。本研究中GNA与仑伐替尼联用后,促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3表达水平升高,抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低,从而诱导了肿瘤组织细胞的凋亡,并且这与已报道的GNA对癌细胞中凋亡相关蛋白的作用基本相符［30］。

本研究中动物给药剂量选定GNA为20 mg/kg与仑伐替尼联用［31-32］,是因为研究结果表明20 mg/kg GNA有抑瘤趋势,且毒性较小,排除了GNA毒性对实验结果的影响;仑伐替尼剂量按照临床上用量及人与小鼠体表面积换算常数得到,然而2.5 mg/kg仑伐替尼临床用量几乎无抑瘤作用,因此在本研究中增加给药剂量,以10 mg/kg仑伐替尼进行后续实验［33-35］。本研究结果表明,GNA联合仑伐替尼对异位移植肿瘤小鼠HCC增殖具有抑制作用,作用强于仑伐替尼单用。GNA和仑伐替尼联用的小鼠肿瘤组织中,细胞凋亡率高于仑伐替尼组。进一步的机制研究发现,GNA与仑伐替尼联用的小鼠肿瘤组织内核受体PXR及下游代谢酶和转运体的表达均被抑制,表明其可能通过减少仑伐替尼在肿瘤细胞内的代谢,增加仑伐替尼的蓄积,从而提高药效。GNA联合仑伐替尼可以使肿瘤组织中促凋亡蛋白表达水平上调,抑凋亡蛋白表达水平下调,从而诱导肿瘤细胞的凋亡进程。

综上所述,GNA与仑伐替尼联用较仑伐替尼单用更能抑制小鼠肿瘤的生长,两药联用可达到协同增效的作用,该作用与GNA调控PXR,下调代谢酶和转运体的表达水平以及调节相关凋亡蛋白的表达水平有关。