肖颖馥,盛 文,张锦明,朱从旭,李波男,何清湖,3△

(1.湖南中医药大学,长沙 410208;2.广东省中医院,广州 511400;3.湖南医药学院,湖南怀化 418000)

糖尿病前期,通常定义为血糖水平高于正常但低于糖尿病阈值的阶段,是糖尿病的高风险状态,年转化率为5%～10%[1]。在全球范围内,糖尿病前期的患病率正在上升,预计到2030年,将有4.7亿人处于糖尿病前期[2]。研究显示,糖尿病前期与早期肾病、慢性肾病、小纤维神经病变、糖尿病视网膜病变和大血管疾病风险增加有关。对糖尿病前期的有效干预可以延缓甚至逆转糖尿病进程,是预防糖尿病及其并发症发生发展的重要机会窗口[3],具有巨大的社会、医疗和经济影响。

动物模型是实验研究的重要载体,通过稳定的模型对疾病的病理生理学、潜在的干预措施和候选药物进行研究和测试,显著地提高了研究人员对疾病发展、演变的理解[4]。虽然糖尿病前期是糖尿病的前驱阶段,但某些干预因素用糖尿病模型进行评估可能显示无效,而用糖尿病前期模型评估则可能有效。此外,糖尿病前期模型可以用来更准确地评估糖尿病前期的恶化因素和防治措施,如果应用糖尿病模型可能会造成结果偏倚[5]。目前已有研究人员进行了糖尿病前期的动物实验研究,创造了多种可行的造模方式,但目前尚无一种公认的理想模型,也暂无综述对糖尿病前期的造模方法进行梳理阐述。因此本研究从实验动物种类、造模方法、造模周期、模型特点、成模标准、高频检测指标、干预方式等方面对国内外糖尿病前期动物实验模型进行归纳,总结不同模型的造模方法、模型原理和模型特点,以帮助研究人员更快速的选择合适的动物模型。

1 资料与方法

1.1 文献来源与检索方法

在中国知网、维普、万方数据库以“糖尿病前期”并且“动物模型”或“鼠”或“兔”或“犬”或“猪”为主题词进行检索,在 PubMed 数据库以“prediabetes” AND “animal model”OR“mouse”OR“rabbit”OR“dog”OR“pig”为主题检索,锁定检索年限限定为 1992 年 11 月至 2022 年 11 月。

1.2 纳入标准

“糖尿病前期”相关的动物模型实验研究文献;造模方法完整;实验过程清晰;文献为原始一次动物实验研究类文献。

1.3 排除标准

会议、报纸、综述等文献;糖尿病前期相关体外实验文献;重复发表文献。

1.4 文献筛选及数据处理

如图1所示,共检索到相关文献305篇,剔除重复文献,根据纳入排除标准,最终纳入文献128篇,其中中文文献31篇,英文文献97篇。实验动物名称、种类等均参照《实验动物和动物实验技术》[6]进行规范总结。将筛选出的文献中实验动物种类、性别、造模方法、造模周期、阳性药、检测指标等数据录入Excel表,建立糖尿病前期动物模型数据库,进行频次和频率的统计。使用Prism软件进行绘图。

图1 文献筛选流程图

2 结果

2.1 糖尿病前期造模动物种类

对 128 篇文献中使用的动物种类进行统计,使用频数>20 的动物共有 3 种,最常用的为 Wistar大鼠(35次,29.4%),其次为SD大鼠(27 次,22.7%)、C57BL/6J小鼠(25 次,21%)。动物年龄多为(4～6)周龄、(6～8)周龄。动物种类分布情况见图2。

2.2 糖尿病前期动物模型动物性别分布

对128 篇文献进行动物性别分布分析,有 26 篇文献未注明动物性别,故不计入统计。结果发现雄性动物应用最多,频数为81次,占比79.4%;雌性动物应用频数为15次,占比14.7%;雌雄各半应用频数为6次,占比5.9%(图3)。相较于雌性大鼠,雄性大鼠可以避免受孕等因素的干扰,且成模率更高,这可能是更多研究人员选择雄性的原因[7]。

图3 糖尿病前期动物模型性别分布

2.3 糖尿病前期动物模型造模方法

对 128 篇文献中的造模方法进行统计分类,可分为饮食诱导、化学诱导、复合造模、基因工程、自发造模5大类。占比最高的造模方式为饮食诱导(85次,66.5%),自发模型为仅次于饮食诱导的造模方式(16次,12.5%),其次为复合造模(13次,102.%)、化学诱导(8次,6.3%)和基因工程(6次,4.7%)。饮食诱导类型可以分为高脂肪饲料诱导、高蔗糖饲料诱导、高脂肪+果糖饲料诱导以及高脂肪+蔗糖饲料诱导,其中高脂饮食诱导为主要造模方式(61次,47.7%)。自发模型中以由JCL-ICR品系小鼠衍生的白内障易感亚型 (CTS) 糖尿病小鼠近亲杂交而来的非肥胖糖尿病(no obesity diabetes,NOD)小鼠为多[8]。复合造模多为高脂肪饮食联合链脲佐菌素(streptozotocin injection,STZ)诱导的造模方式,通常为高脂饲料喂养4～8周后予STZ单次腹腔注射,STZ的剂量多为15～20 mg/kg,也有高糖高脂饲料喂养联合STZ少量多次腹腔注射(每次10 mg/kg,累计剂量30 mg/kg)诱导的糖尿病前期模型。化学诱导中以单次腹腔注射STZ(40 mg/kg)居多。不同的造模方法其模型特点有所不同,具体见表1。

表1 不同类型糖尿病前期动物模型的造模方法及特点

2.4 饮食诱导的饲料类型、配比

128篇文献中有85篇文献采用饮食诱导方法进行造模,因此本文对饮食诱导造模所选用的不同饲料类型进行统计,依据饲料成分配比分为高脂肪饲料、高蔗糖饲料、高脂肪饮食+果糖饲料、高脂肪饮食+蔗糖饲料。高蔗糖饲料为饮用水中加入蔗糖配制成蔗糖溶液,蔗糖占比主要为30%～35%。果糖饲料以15%的果糖水为主要配比。高脂肪饲料中,碳水化合物供能比主要为20%～40%;蛋白质供能比主要为20%～40%;脂肪供能占比主要为50%～60%(25次,48.1%),其次为40%～50%(16次,30.8%),具体分布详见表2。

表2 高脂肪饲料中脂肪供能比

2.5 糖尿病前期大小鼠造模周期

128篇文献中,大小鼠均为主要的糖尿病前期造模动物,故对大小鼠的造模周期进行统计。以“t”代表造模周期,统计结果发现,在大鼠实验中以16周≤t≤20周的造模周期最多;在小鼠实验中以11周≤t≤15周的造模周期最多,具体见表3。

表3 糖尿病前期动物模型造模周期表(频数/次)

2.6 糖尿病前期动物模型成功制备标准

动物模型的成功复制是动物实验中至关重要的环节,模型成功建立的评价标准尤为重要。在检索到的动物实验中有17篇文献没有提及模型成功制备标准,共有111篇文献表述模型成功制备的评定要素。其中,空腹/餐后血糖、血清胰岛素水平、葡萄糖耐量是评估模型成功的重要指标。大部分文献以空腹血糖或糖负荷2小时血糖升高(5.6 mmol/L<空腹血糖<7.0 mmol/L,7.8 mmol/L<糖负荷后2 h血糖<11.1 mmol/L)、胰岛素抵抗作为成模判定标准。此外,也有不少文献以美国ADA糖尿病前期诊断标准作为造模成功判定标准,具体见表4。

表4 糖尿病前期动物模型成功制备标准

2.7 糖尿病前期动物模型高频检测指标

将涉及体内动物模型的128篇文献中的实验检测指标进行分类,若同一组织检测指标手段、项目类型相同,如用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)同时检测血清中的丙二醇(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)含量,则将其归为一类[36];若同一组织检测手段为不同类型,如血清检测血清胰岛素(INS)和糖化血红蛋白(HbA1c)等指标,则分开计算。通过对检测指标的梳理,选取频数≥5 次的指标。其中,空腹血糖检测频数最高,为 52 次,占比17.4%;其次为糖耐量实验、ELISA法检测血清胰岛素及体质量,频数分别为46、38和37次,分别占比15.4%、12.8%和12.4%,见表5。

表5 糖尿病前期动物模型高频检测指标表(频数≥5)

2.8 糖尿病前期动物模型干预方式

在糖尿病前期的体内动物实验中,涉及干预方式的文献共有 52 篇,根据干预方式的不同可以分为5大类,分别是西药、中药和中药提取物、植物和植物提取物、运动以及饮食干预。西药为占比最高的干预方式(15次,28.8%),以二甲双胍为主要代表药物,其次为中药及中药提取物(14次,26.9%)、植物及植物提取物(12次,23.1%)。运动也是干预糖尿病前期的重要方式(6,11.5%),详见表6。

表6 糖尿病前期动物模型干预方式

3 讨论

3.1 常用实验动物分析

目前用于制备糖尿病前期的动物种属有大鼠、小鼠、猪以及狗,大鼠中 Wistar大鼠、SD大鼠、ZDF大鼠、OLETF大鼠为常用动物,Wistar大鼠在饮食(高脂饮食、高蔗糖饮食、高脂肪+蔗糖)、高脂饮食+STZ、STZ相关的5种造模方法中均有应用。SD大鼠主要在高脂肪饮食、高脂肪饮食+果糖、高脂肪+蔗糖、高脂饮食+STZ、3脱氧葡萄糖醛酮相关的造模方法中使用。ZDF大鼠、OLETF大鼠为自发性造模大鼠,二者的主要表型有肥胖、胰岛素抵抗及高血糖。小鼠中C57BL/6J小鼠、NOD小鼠、BALB/c小鼠为常用小鼠。C57BL6/J小鼠主要应用在高脂肪饮食、高脂饮食+STZ的造模方法中,BALB/c小鼠主要应用于化学诱导造模中。NOD小鼠是一种自发性非肥胖糖尿病小鼠,是典型的1型糖尿病模型,在未发展为1型糖尿病前可作为1型糖尿病前期的研究模型。狗及猪的动物饲养成本均较高、实验操作难度偏大,且繁殖周期长,所以糖尿病前期动物模型中该动物种属选择偏少。

3.2 常用造模方法分析

饮食诱导法是利用高糖高脂的饮食连续饲喂实验动物,因为高脂肪饮食会导致体重增加,随着时间的推移,会出现持续高血糖,血清胰岛素水平会逐渐增加,进而出现胰岛素抵抗[37]。饮食诱导的糖尿病前期模型多表现肥胖、血糖升高、糖耐量受损、血清胰岛素水平升高等特征,能很好地模拟人类糖尿病前期的发病和进展,被人们所青睐。但该方法造模时间较长,多数大鼠的造模周期为16～20周,小鼠造模周期为12～16周。同时,饮食诱导的糖尿病前期大鼠需维持高脂饲料喂养。研究显示将糖尿病前期小鼠的高脂饲料切换到标准饲料喂养,可减轻糖尿病前期小鼠的体重,降低血脂水平及改善胰岛素敏感性[38]。

化学诱导法是指通过化学致病因素损伤动物胰岛、破坏胰岛细胞,引起胰岛素合成减少或拮抗胰岛素作用引起胰岛β细胞功能紊乱,进而导致糖代谢异常。主要的化学致病因素有STZ、四氧嘧啶及3-脱氧葡萄糖醛酮。STZ和四氧嘧啶的机理相似,主要模拟1型糖尿病前期病理表现[19,39];3-脱氧葡萄糖醛酮诱导法是通过灌服3-脱氧葡萄糖醛酮,使其沉积于动物肠组织,引起羰基压力和氧化压力增加,进而增加结肠黏膜通透性,损伤肠组织L细胞,使循环活性氧、炎症因子水平升高、GLP-1介导的肠促胰岛素效应减弱,引起胰岛β功能紊乱。主要表现有葡萄糖调节受损,并伴有明显的胰岛细胞功能障碍[40]。

自发性糖尿病前期动物模型是指在自然条件下,未经过人工处理而发病的实验动物,主要动物品系有GK、ZDF、BB、OLETF大鼠和db/db、NOD小鼠。这些动物在自然条件下可自发发展为糖尿病模型,在血糖正常至发展为糖尿病的中间过渡阶段属于糖尿病前期,不同的自发性糖尿病模型有不同的发病机制,BB大鼠、NOD小鼠模拟1型糖尿病前期模型,GK、ZDF、OLETF大鼠和db/db小鼠模拟2型糖尿病前期模型[41-42]。根据不同机制和病理表现,可用于不同类型的抗糖尿病前期药物的评价。

基因工程动物模型是利用基因修饰技术对特定DNA片段进行定点替换、敲除或敲入来实现基因表达的上调或下调,从而构建基因相关的动物模型。目前糖尿病前期的基因工程动物模型有B细胞克隆、Tspo基因敲除及葡萄糖激酶基因敲除。葡萄糖激酶是葡萄糖代谢途径中的一种限速酶,敲除葡萄糖激酶会导致葡萄糖刺激胰岛素分泌受损和高血糖,但不会导致糖尿病。Tspo基因敲除的小鼠,血糖水平符合糖尿病前期诊断标准,但对促肾上腺皮质激素没有反应,适合于血糖及应激关系的研究。

3.3 造模周期分析

不同造模方法的造模周期各不相同,饮食造模主要为通过高脂饲料的长时间喂养,导致胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱,造模周期偏长,需要12～16周[43]。化学造模、基因工程造模及复合造模的造模周期相对要短一些。自发性造模周期则与大小鼠的品种相关,如db/db 小鼠在1个月时开始贪食及发胖, 继而产生高血糖、高血胰岛素等糖尿病前期的表现;ZDF 大鼠在4周龄时出现胰岛素抵抗和高血糖;GK大鼠以2～3周龄为多[44]。

3.4 高频检测指标分析

空腹血糖、糖耐量试验及血清胰岛素检测是高频检测指标。空腹血糖为隔夜空腹(至少8～10 h)后采集血液检测出的血糖值,反映动物模型的基础血糖,一般空腹血糖升高代表存在血糖调节不良[45]。糖耐量试验是通过给予糖负荷后测定多个时间点的血糖,综合评估血糖水平的变化趋势和时间累积效应,用以了解胰岛β细胞功能和机体对血糖的调节能力[46]。通常口服或者腹腔给予葡萄糖后血糖水平会迅速升高,进而刺激机体分泌胰岛素以降低血糖水平[47]。如果测试后血糖不能在短时间恢复到正常水平,则认为该动物存在糖耐量异常,可结合血清胰岛素水平进一步判断动物胰岛素抵抗和胰岛分泌功能。在生化指标中,血脂、炎症细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)也是高频检测指标,反映脂代谢紊乱和炎症因子是糖尿病前期研究的热门内容,对今后病理、药理机制研究具有一定的指导意义。

3.5 阳性药物种类分析

在西药干预中,西药以双胍类和GLP-1为主,干预中药主要包括复方中药和单味中药提取物,中药复方主要包括芪山颗粒、脾瘅宁、葛根芩连汤、四君子颗粒等,复方多有健脾功效。中药提取物主要包括地黄提取物、金银花提取物、黄连提取物、荞麦提取物、木蝴蝶提取物,多具有清热的功效。中药改善糖尿病前期的主要机理有抑制α-葡萄糖苷酶、增加肠道GLP-1的分泌、改善肠道微生物群和抗氧化损伤[48-49]等。

4 讨论

通过对4种数据库糖尿病前期动物模型文献的统计分析发现,糖尿病前期动物模型主要以鼠类为主要来源,大鼠以Wistar和Sprague Dawley为主,小鼠以C57BL/6J为主;造模方法以饮食诱导大(小)鼠糖尿病前期模型为主,在高脂饲料饮食配比上,脂肪供能占比主要为50%～60%,碳水化合物供能比主要为20%～40%,蛋白质供能比主要为20%～40%,造模周期相对偏长,大部分在16～20周左右。其次,自发造模的糖尿病前期模型也比较常用,不同的自发模型大鼠各有其模型特点和适用性,可根据不同的研究需求适当选择。在高频检测指标中,以空腹血糖、糖耐量试验(OGTT、IPGTT)、血清胰岛素检测为主,以判定模型的胰岛素抵抗和糖代谢情况;在干预方式中,西药以二甲双胍为主,中药有芪山颗粒、脾瘅宁等复方,也有地黄、金银花及黄连等提取物。

目前围绕糖尿病前期发病机制及病因而研发的动物模型不断增多,但仍有一定的局限性:①目前最常用的高脂饲料诱导模型,能够较好模拟糖尿病前期典型特征,但该模型建模周期长,成本高,血糖升高存在个体差异。基因工程模型现仍处于摸索阶段,技术难度大,难以大规模应用[50];自发模型进展为糖尿病的时间各不相同,品系较为繁杂,模型动物的病变发展特性与人类有所差异,且成本高,模型较难控制[51]。复合造模的方法虽造模时间短,但化学诱导剂的用量和注射方式尚未统一,需要进一步的实验研究和论证。因此,目前糖尿病前期动物模型虽有多种造模方式,但仍存在进一步发展和改良的空间。②虽然目前的糖尿病前期动物模型可以较好地模拟高血糖、胰岛素抵抗、胰岛素功能障碍的典型特征,但对糖尿病前期模型在肾脏、心脏、血管等方面的评估尚缺少有力的证据,且不同糖尿病前期模型在胰腺、肝脏等病理学改变也缺乏比较研究。③中医药是糖尿病前期重要的干预方式,糖尿病前期在中医中归属“脾瘅”范畴,辨证可分为湿热蕴脾、气阴两虚、脾虚湿盛等证型[52],但在四个数据库检索到的造模方法中暂无病与证结合的模型,仅以西医成模标准来说明模型成立,即给予中医药干预治疗,这些实验方法虽可行但缺乏一定的科学性。

动物模型是临床研究和实验研究的桥梁,制备理想的动物模型是开展实验研究的前提。本文通过文献梳理及数据分析,对近30年糖尿病前期动物模型的造模方法、模型特点、优缺点及判定标准进行整理比较,并针对其个别不足之处进行探讨,希望本文可以为今后广大研究者建立更加简便可行、稳定且更符合发病机理的动物模型提供参考。