孙道凡，孟波，陈骏萍

作者单位： 241002 安徽省芜湖，皖南医学院（孙道凡、陈骏萍）；宁波市第二医院（孟波、陈骏萍）

慢性低度炎症是指病原体、内源性细胞碎片等刺激免疫细胞，进而产生低水平炎症介质，表现为循环中促炎症介质水平升高，包括白介素（IL）-1、IL-6、IL-8、IL-13、IL-18、C-反应蛋白（CRP）及肿瘤坏死因子（TNF- ）[1-2]，其中升高最为明显的是CRP、IL-6 和TNF-[3]。迄今为止，慢性低度炎症相关研究大都集中于代谢性疾病、肿瘤性疾病等机体外周系统或器官相关疾病，仅有少量研究关注于中枢神经系统。在一项对肥胖患者的实验中发现，低度炎症是肥胖群体出现注意力不集中的危险因素[4]。另有临床前实验结果显示，老龄鼠年龄相关的空间学习和记忆缺陷与慢性低度炎症有关[5]。本研究旨在研究不同程度慢性低度炎症对中枢神经系统炎症与认知功能的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性C57BL/6JNifdc小鼠，8 周龄，体质量18 ～20g，由宁波大学实验动物中心统一购买（浙江省维通利华实验动物有限公司），饲养于宁波大学实验动物中心，本研究由宁波大学实验动物伦理委员会批准。脂多糖（LPS，规格：2 ml，1 mg/ml，Sigma公司），IL-6、TNF- 酶联免疫分析试剂盒（规格：96 孔/kit，依科赛公司），酶标免疫分析仪（型号：iMark，美国Biorad 公司），免疫荧光Iba-1（规格：100g，Abcam 公司），驴抗山羊IgG Alexa Fluor 488（规格：500g，Abcam公司），共聚焦显微镜（SP8，Leica公司），旷场（规格：50 cm×50 cm×50 cm，上海欣软信息科技有限公司），新物体识别（规格：40 cm ×40 cm ×40 cm，上海欣软信息科技有限公司）。

1.2 动物模型制备 慢性低度炎症小鼠模型主要参考Rorato 等[6]方法：LPS（Escherichia coli 0111:B4）100、200 及500g/kg 连续腹腔注射共6 d，按照随机数字表法将80 只C57 小鼠分成Sham组、L组、M组及H 组，每组各20 只。L 组连续6 d 注射LPS，每天按100g/kg 注射，M 组和H 组LPS 则分别按200g/kg 和500g/kg 注射6 d，Sham 组则连续6 d注射等量0.9%氯化钠注射液。

1.3 酶联免疫分析检测 造模完成后第1 天，经小鼠眼眶取得全血，静置2 h 后，4 ℃1 000（×g）离心15 min，吸取上清液于EP 管中。小鼠经2.5%三溴乙醇麻醉后取海马组织，加入10倍体积的1×PBS，超声破碎后放入-20 ℃冰箱，反复冻融2 次破坏组织碎片，4 ℃5 000（×g）离心5 min，吸取上清液，用酶联免疫吸附试验检测炎症因子IL-6 与TNF- 浓度。

1.4 免疫荧光检测 造模完成后第7 天，小鼠经2.5%三溴乙醇麻醉后由心尖依次灌流4 ℃0.9%氯化钠注射液及4 ℃4%多聚甲醛，取出小鼠全脑后泡入4%多聚甲醛4 ℃过夜保存，再依次用15%及30%的蔗糖溶液给大脑脱水，待其完全沉底后，包埋剂包埋后冷冻切片机切25m 薄片贴于载玻片上，经抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAPI染色、盖盖玻片及封片后在莱卡共聚焦显微镜下观察并记录。

1.5 旷场实验 造模完成后第1 天，小鼠在暗适应1 h 后置于50 cm×50 cm×50 cm 的旷场箱中自由活动，摄像头下观察小鼠在5 min 内的运动距离。每只小鼠完成旷场实验后清除排泄物并用75%的酒精擦拭箱底，防止气味对实验的干扰。

1.6 新物体识别实验 造模完成后第2 和3 天，小鼠在暗适应1 h 后置于40 cm×40 cm×40 cm 实验箱中。实验分为两个阶段：（1）第1 天的训练阶段，在旷场中放置两个大小形状一模一样的A1 和A2 物体（直径5 cm 高5 cm 的圆柱形物体），物体放置的位置距离相邻两个旷场壁10 cm，将小鼠面向两物体的中央放置，观察记录5 min 对A1 和A2 物体的探索时间。（2）24 h 后进行测试实验，将A2 物体换成颜色形状完全不一样的B 新物体（直径5 cm 的球体），将小鼠放入其中分别观察记录其对A1 和B 物体的探索时间。摄像机下记录小鼠在距离A1、A2（B）物体2 cm 周围的探索时间，其中小鼠用胡须探查或用爪接触A1、A2（B）物体都被视为探索，攀爬及围着A1、A2（B）物体转圈则不视为探索。每只小鼠完成实验后清除排泄物并用75%的酒精擦拭箱底，防止气味对实验的干扰。小鼠辨别指数（RI）=B探究时间/（A1 探究时间+B 探究时间），RI 值越大，小鼠视觉记忆能力越好。

1.7 统计方法 数据采用SPSS25.0 软件分析，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清IL-6 及TNF- 水平比较 M 组及H组小鼠血清IL-6水平显著高于Sham组及L组（t≥4.15，均P ＜0.05），L 组、M 组及H 组小鼠血清TNF- 水平显著高于Sham 组（t≥2.23，均P ＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠血清IL-6 及TNF- 水平 pg/ml

2.2 各组小鼠海马IL-6 及TNF- 水平比较 各组小鼠海马IL-6 及TNF- 水平差异均无统计学意义（均P ＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠海马IL-6 及TNF- 水平 pg/ml

2.3 海马小胶质细胞活化水平 M 组及H 组小鼠海马CA1 区域小胶质细胞激活情况显著高于Sham组及L 组（t≥2.41，均P ＜0.05），见图1 及表3。

图1 小鼠海马小胶质细胞激活情况（DAPI 染色）

表3 各组小鼠海马小胶质细胞激活情况

2.4 运动及情绪状态比较 各组小鼠旷场运动总距离差异无统计学意义（P ＞0.05），H 组鼠中心区域时间显著少于其他组（t≥6.03，均P＜0.05），见表4。

表4 各组小鼠运动总距离及中心区域时间比较

2.5 视觉记忆能力 各组小鼠RI 指数差异无统计学意义（均P ＞0.05），见表5。

表5 各组小鼠RI 值比较

3 讨论

慢性低度炎症临床前研究多采用LPS进行模型诱导，但也有研究使用10%酪蛋白诱导[7]。然而，由于受实验室条件差异等因素的影响，不同研究者使用的LPS浓度不尽相同，如100g/kg LPS 连续腹腔注射6 d[6]，500g/kg LPS 连续腹腔注射2 周[8]，每天LPS 皮下定时释放3.3g 和33.3g 等[9]。基于已有研究成果，结合团队预实验结果，本研究采用了100、200 及500g/kg3种LPS浓度梯度，分别腹腔注射6d。

本研究结果显示，M 组及H 组小鼠血清IL-6 水平显著高于Sham 组及L 组（均P ＜0.05），L 组、M组及H组小鼠血清TNF- 水平显著高于Sham组（均P＜0.05）；各组小鼠海马IL-6 及TNF- 水平差异均无统计学意义（均P ＞0.05）。此外，即使低浓度100g/kg LPS也可导致海马小胶质细胞激活增多，且活化状态在造模完成后的第7 天仍然显著，这表明中枢炎症反应持续时间至少为1 周。小胶质细胞作为中枢神经系统防守第一道闸门，炎性因子进入中枢后促使位于中枢神经系统的小胶质细胞从静息态分化为具有吞噬促炎的M1 型小胶质细胞以及具有修复组织抗炎的M2 型小胶质细胞[10]，激活的小胶质细胞以自分泌方式分泌炎性因子IL-1 ，从而促进炎症因子的产生，使得小胶质细胞进一步活化参与到中枢的促炎与抗炎过程[11]。这些炎性因子可以进一步导致神经元细胞死亡[12]、乙酰胆碱释放减少[13]、谷氨酸能传递减弱[14]，从而使机体学习和记忆功能受损。有研究结果显示，830g/kg LPS 单次腹腔注射会显著引发小鼠出现恐惧焦虑情绪，表现为中心区域活动时间显著减少[15]。另有研究表明1 mg/kg LPS 单次腹腔注射引发的急性炎症会促使新生小鼠出现认知功能障碍[16]。此外，5mg/kgLPS 连续腹腔注射1 个月后小鼠出现脓毒血症，脓毒血症小表现为显出著的认知功能损伤[17]。本研究结果表明，每天500g/kgLPS连续腹腔注射6d小鼠运动能力无明显改变但出现恐惧焦虑情绪，在视觉记忆能力方面则没有出现变化。

利益冲突 所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明 孙道凡：实验操作、论文撰写、数据整理、统计学分析；孟波、陈骏萍：研究指导、论文修改、经费支持