水飞蓟宾糖基化衍生物对肝癌细胞凋亡和周期的影响

2023-08-04黄玮玮孙晶晶潘金明庄思静姜晓杰曹宇席建军庄让笑

现代实用医学 2023年6期

黄玮玮，孙晶晶，潘金明，庄思静，姜晓杰，曹宇，席建军，庄让笑

作者单位： 310012 杭州，杭州市西溪医院

水飞蓟素是从水飞蓟的种子中提取出来的一种黄酮木质素类混合物，水飞蓟宾（SLB）是水飞蓟素中最具药理活性的成分，占水飞蓟素总量的60%～70%[1]。SLB 具有抗氧化，维持细胞膜稳定的作用，被广泛用于治疗各种肝病[2-3]。药理学研究显示，SLB能够通过抑制肿瘤受体型酪氨酸激酶（RTK）的活性，如抑制表皮生长因子受体1（EGFR）和胰岛素样生长因子1 受体（IGF-1R）及其下游信号分子的活化等途径，对肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌及舌癌等具有良好的抑制作用[4-5]。SLB 还可增强化疗药物的疗效及逆转多药耐药（MDR）的发生[6-7]，但其较差的水溶性（溶解度为430 mg/L）、较低的吸收度和生物利用度（吸收率20%～50%）严重影响其临床治疗效果[8-9]。笔者前期课题利用药物糖基化对SLB 进行结构修饰，得到其糖基化衍生物，见图1。本研究拟探讨SLB 糖基化衍生物对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响，报道如下。

图1 SLB 糖基化衍生物结构

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞人肝癌细胞LIXC-002，上海研卉生物科技有限公司产品。

1.1.2 主要试剂 SLB 衍生物（SLB-X2），浙江大学医学院附属杭州西溪医院制剂室制作，纯度≥99%。SLB，纯度≥98%，购买于武汉克米克生物医药技术有限公司。胎牛血清购买于Hyclone 公司，青链霉素购买于Sigma公司，RPMI-1640 培养基购买于Rockville公司，胰蛋白酶购买于Gibco 公司，细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒购买于南京建成生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备 FORMA 700 型超低温冰箱（Thermo 公司），YC-300L 型药品储存柜（中科美菱低温科技有限责任公司），SW-CJ-2FD型超净化工作台（苏州净化设备有限公司），3K15 型低温高速离心机（Sigma 公司），BS224 型电子天平（北京塞多利斯仪器系统有限公司），Forma 3111 型水套式CO2培养箱（Thermo Electron company），Beckman DxFlex 流式细胞仪（美国Beckman 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将LIXC-002 细胞加入到含有青链霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培养基中，于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 分组实验分为空白对照组（Control）、SLBX2（3mol/L）组、SLB-X2（10mol/L）组、SLB-X2（30mol/L）组及SLB 对照组（30mol/L）。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡根据分组方式加入对应化合物于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化30 s，加入完全培养液终止消化，800 r/min离心5 min，弃上清，每管加入0.5 ml 染色缓冲液重悬细胞，然后每管加入5l Annexin V-FITC 染液，轻柔吹打混合均匀后，加入5l Propidium Iodide，混匀，室温条件下避光孵育15 min，然后上流式细胞仪进行检测。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期取对数生长期的细胞接种至6 孔板，用无血清的培养基孵育24 h 使细胞同步化，随后按照分组方式加入对应化合物于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，加入2 ml 0.25%不含有EDTA 胰蛋白酶消化，800 r/min，4 ℃，离心5 min，弃去上清，使用体积分数为70%的冷乙醇500l对细胞进行重悬，4 ℃固定过夜。800 r/min 离心15 min 收集固定细胞，用0.4 ml PBS 重悬细胞并转至Tube 中轻轻吹打，加RNase-A 约3l 至终浓度约为50g/ml，37 ℃水浴消化30 min，然后加PI 约50l至终浓度约为65g/ml，在冰浴中避光染色30min，用300 目尼龙网过滤，然后流式细胞仪进行检测。1.3 统计方法数据采用Graphpad Prism 9（Version 9.4.0）进行分析与作图，Adobe Illustrator 2022（Version 26.3.1）进行整理合图。计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用Dunnett-t 检验。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLB-X2 对LIXC-002 细胞凋亡的影响在给予SLB-X2 处理后细胞凋亡率明显上升，不同浓度SLB-X2（3、10 及30mol/L）处理的LIXC-002 细胞凋亡率分别为13.22%、16.40%和21.24%。与空白对照组比较，细胞凋亡率显著上升（t≥8.62，均P ＜0.05），且随着浓度的增加凋亡率进一步上升。与SLB 组比较，相同浓度下，SLB-X2 上调凋亡率能力是SLB 的2 倍（t=11.45，均P ＜0.05），见图2 和封三彩图1。

图2 细胞凋亡实验结果

图1 SLB-X2 及SLB 对LIXC-002 细胞凋亡的影响

2.2 SLB-X2 对LIXC-002 细胞周期的影响与空白对照组比较，SLB-X2 组G0/G1、S 期的细胞数量显著减少，而G2/M 期细胞数量显著上升（t≥3.26，均P ＜0.05）；不同浓度SLB-X2 G2/M 期细胞数量为23.83%、28.03%、29.21%，提示细胞周期被阻滞于G2/M 期。与SLB 组比较，在相同浓度下，SLB-X2的细胞阻滞作用更强（t≥2.65，均P ＜0.05），见图3和封三彩图2。

图3 处在不同细胞周期的细胞数量结果

图2 SLB-X2 和SLB 对LIXC-002 细胞周期的影响

3 讨论

2007 年索拉非尼被批准用于晚期肝细胞癌（HCC）患者的标准姑息疗法[10]，然而索拉菲尼对胃肠道和皮肤产生的不良反应以及耐药性使其临床应用受到巨大影响[11]。除索拉菲尼外，其他细胞毒性的化疗药物，都因严重不良反应对临床应用产生了巨大影响[12]，因此高效、低毒的植物药在研发抗肿瘤药物上有很大潜力。

药物糖基化后糖基部分能够通过增加溶解性、调节血浆半衰期和提高与作用位点结合的特异性来改变母体药物的药理活性，因此药物糖基化成为药物结构改造和修饰的常用手段。SLB 在治疗肝脏疾病上已经有悠久的历史，近年来其抗肿瘤活性备受关注[13]，然而生物利用率低抑制了SLB 的发展。本研究旨在将SLB 糖基化修饰提高水飞蓟宾抗肿瘤活性，结果显示SLB-X2 具有比SLB 更加优良的促凋亡活性。本研究检测了化合物对细胞周期的影响，在给予不同浓度的SLB-X2 后，细胞被阻滞在G2/M期，相同浓度下，SLB-X2 的细胞阻滞作用也明显优于SLB。研究表明，SLB 糖基化修饰后，其体外抗肿瘤活性得到明显改善，对肝癌细胞的细胞周期以及凋亡都具有影响，在低浓度下其抗肝癌活性明显优于SLB。