邱筱婷,巩红校,朱 玲,霍星星

原发性干燥综合征(primary Sjogren′s syndrome,pSS)是一种慢性系统性自身免疫性疾病,主要靶器官是泪腺和唾液腺等外分泌腺[1]。其病理表现为淋巴细胞浸润和自身抗体的产生,临床主要表现为口干和眼干。部分病人可后期发展为冷球蛋白血症和弥漫性大B细胞淋巴瘤[2]。目前尚无系统的理论来解释pSS的发生、发展,其受遗传、环境和性激素等多因素影响致病。先天性免疫和适应性免疫途径的异常调节在pSS的免疫和炎症反应中起重要作用[3]。B细胞、效应T细胞、辅助性T细胞包括Th17和Th22细胞可能是免疫系统失调和疾病发展中的重要影响因子[1],参与这一系统性疾病的发展。本研究对实验性干燥综合征(ESS)小鼠的唾液腺组织和唾液进行转录组测序和蛋白质组学关联分析,鉴定pSS的差异基因和蛋白及相关的生物过程和信号通路,分析RNA转录水平和蛋白质丰度之间的相关性,以期增加对pSS潜在分子途径的认识。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 清洁C57BL/6小鼠,雌性,6～8周龄,体质量(18±2)g,购于安徽医科大学动物实验中心,饲养于动物房,恒温恒湿环境,自由进食。弗氏完全佐剂(F5881,Sigma公司),弗氏不完全佐剂(F5506,Sigma公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012,碧云天生物技术);毛果芸香碱(p6503,Sigma公司)。

1.2 ESS小鼠模型建立 适应性饲养1周后,将小鼠随机分为对照组和模型组,对照组不作处理,模型组通过小鼠唾液腺蛋白诱导建立ESS模型[4]。具体方法为:取模型组小鼠颌下腺,低温研磨仪将组织研磨打碎,离心后取上清液,BCA试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等体积混合乳化至浓度2.0 mg/mL。于第0、7、14天,腹背部皮内多点注射弗氏完全佐剂乳化的蛋白抗原,0.1 mL/20 g。免疫第4周,注射弗氏不完全佐剂乳化的蛋白抗原。免疫完成及2周后,棉花差量法收集测量小鼠唾液,通过唾液量的变化及病理组织评估小鼠ESS模型[5-6]。

1.3 转录组测序样品准备和分析 使用TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取和纯化总RNA。NanoDropND-1000(NanoDrop,Wilminnton,DE,USA)测定每个样品中RNA数量和纯度。生物分析仪(Agilent 2100,CA,USA)测定RNA完整性,并通过变性琼脂糖凝胶电泳进行验证。fastq格式的下行原始数据使用Cutadapt程序进行处理,使用HISAT2程序绘制基因组读数,StringTie与默认参数一起使用来编译每个示例的映射读数。所有样本的转录组使用“gffcompare”组合,创建一个完整的转录组。采用StringTie和ballgown检测所有转录本的表达水平,并通过计算FPKM检测mRNA的表达水平。使用“edgeR”或“DESeq2”R包,通过FC>2或<0.5和P<0.05选择差异表达的mRNA,用于通路分析。

1.4 蛋白样本准备和LC-MS/MS分析 将样品放入裂解缓冲液(2% SDS,7 mol/L尿素,1 mg/mL蛋白酶抑制剂)中,用超声匀浆器在冰上匀浆3 min。离心机中14 000 r/min于4 ℃下离心30 min,收集上清液。采用BCA蛋白含量测定试剂盒测定上清液中的蛋白含量。然后将50 μg蛋白悬浮于50 μL溶液中,用1 mol/L二硫苏糖醇在55 ℃下还原1 h,用5 μL 1 mol/L碘乙酰胺在黑暗中烷基化1 h,然后用300 μL预冷丙酮沉淀该材料,胰蛋白酶用于过夜消化沉淀。然后进行高pH反相分离,利用Ultimate 3000系统(ThermoFisher Scientific,MA,USA)连接到反相柱(XBridge C18柱,4.6 mm×250 mm,25 mm,5 m)(Waters Corporation,MA,USA),采用线性梯度从5%～45% B在40 min内进行高pH分离(B:20 mmol/L甲酸铵,80% ACN,pH 10.0,氢氧化铵调节)。

将肽重新溶解在30 μL溶剂A(0.1%甲酸水溶液)中,并使用在线纳米喷雾LC-MS/MS(ThermoFisher Scientific,MA,USA)连接到EASY nLC 1200系统的Orbitrap Fusion Lumos上进行分析。质谱仪设置为依赖数据的采集模式,并在MS和MS/MS模式之间自动转换。原始DDA数据通过Spectronaut X (Biognosys AG,Switzerland)处理,以构建初始目标列表。q值(FDR)极限设为1%。将DIA数据与DDA参考数据库进行比较,以鉴定蛋白质。差异表达蛋白用FC>1.2和P<0.5检测。

1.5 功能富集分析 Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)基因富集分析用于通路分析,识别失调通路[7]。基因之间通过相互作用促进生物过程,基于通路的分析可以更好地了解基因的生物活性。通过与整个基因组背景的比较,检测到高度富集的代谢或信号传递途径。

1.6 转录组和蛋白组相关度分析 相关性分析采用R(v.3.5.1)方法进行。基于转录组和蛋白质组中基因表达的变化,创建九象限图,并对图谱的九个象限的基因进行定量和富集分析。利用转录组和蛋白质组的KEGG通路信息评估其相关性,比较2组代谢途径的异同。

1.7 蛋白质互作网络(PPI)分析 STRING数据库具有大量的蛋白质相互作用数据,用于分析差异表达基因(DEGs)的相互作用[8]。

1.8 统计学方法 采用t检验、方差分析和q检验。

2 结果

2.1 ESS模型评价 通过唾液量和组织学评估ESS模型建立情况,病理结果显示,对照组小鼠颌下腺在实验期间无明显变化,模型组小鼠颌下腺第6周开始出现淋巴细胞浸润,第8周浸润进一步加深,伴见腺泡细胞破坏(见图1);模型组小鼠唾液量亦出现明显改变,第0周2组唾液量差异无统计学意义(P>0.05),第6、8周模型组小鼠唾液量均明显少于对照组(P<0.01)(见表1),提示ESS小鼠模型建立成功。

表1 2组小鼠唾液量比较

2.2 差异表达基因(DEGs)识别和生物信息分析 高通量RNA测序后分析pSS唾液腺组织与正常样品的差异mRNA表达,在26 575个RNA转录本中鉴定出3 221个差异表达基因(FC>2,FDR<0.05)。其中,在pSS唾液腺组织中2 149个基因上调,1 072个基因下调(见图2A、B)。GO富集分析显示,差异表达基因按细胞成分(CC)、生物过程(BP)和分子功能(MF)分类。在生物过程组分中,差异表达基因主要富集于细胞过程、生物过程调控及代谢过程;细胞成分主要集中在细胞、细胞部分和细胞器方面;分子功能分析发现差异表达基因的结合能力显著增强。KEGG分析显示,在340条通路中明显富集,尤其是TNF信号通路、MAPK信号通路、HTLV-I感染和凋亡。前20个富含GO的术语和途径见图2C、D。

2.3 差异表达蛋白(DEPs)识别和生物信息分析 通过实施基于LC-MS的无标记方法对唾液样品的蛋白质组进行分析,FC>1.2和FDR<0.05的蛋白质被认为是显著的差异表达蛋白,共检测到2 164个蛋白质,其中253个蛋白质表现出差异表达(Benjamini-Hochberg校正后P<0.05)。在差异表达蛋白中,116种蛋白质上调,137种下调(见图3A、B)。类似地,GO中生物过程失调的术语主要在细胞、代谢和免疫过程中丰富;细胞成分主要富集在细胞外区域、细胞和细胞部分;分子功能差异表达蛋白在结合和催化活性方面显著富集。KEGG分析显示,金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联反应、主要免疫缺陷、系统性红斑狼疮和B细胞受体信号通路丰富。前20个富含GO的术语和途径见图3C、D。

2.4 mRNA和蛋白的相关分析 通过进一步分析RNA与蛋白质丰度之间的相关性,以全面评价ESS发生机制中的RNA-蛋白质关系,结果显示,识别的所有蛋白与基因表达数据之间的相关性较低。相比之下,当仅应用差异表达基因和差异表达蛋白时,检测到了较高的关联。在蛋白质-RNA丰度的相关分析中,检测到50.93%的阳性相关和7.18%的显著相关,mRNA/蛋白质比值的相关性具有统计学意义(中位数=0.029,P<0.05)(见图4A)。

整合所有DEGs和DEPs显示,共61个基因重叠,其中31个变化趋势一致(cor-DEGs-DEPs),30个趋势不一致(diff-DEGs-DEPs)。分析了相关的功能富集和途径,GO富集分析表明,DEGs-DEPs在BP中富集于代谢过程和生物调控(见图4B);对于CCs,细胞、细胞外相关区和部分主要富集(见图4C)。KEGG通路分析显示,肾素-血管紧张素系统(RAS)和溶酶体途径是主要富集的通路(见图4D)。根据转录组和蛋白质组中基因表达变化构建九象限图(见图5A),一些基因在RNA和蛋白质水平上显示相同的差异倍数。进一步探索一些基因RNA和蛋白质水平之间最显著的差异,如散点图所示,在唾液样本中,FN1、HPX、LCN2和SERPHING1蛋白表达下调,而其RNA水平增加了近2倍,HPX水平增加了11倍,此外,其他基因的RNA和蛋白质水平之间的差异更大,如Krt15,在基因水平上有3.5倍的变化,但在蛋白质水平上增加了15.6倍,DEGs与其相应DEPs之间存在相同的上升趋势,在pSS发病机制中可能发挥重要作用(见图5B)。热图显示,九象限图的第3象限中的cor-DEGs-DEPs具有明显的组间差异(见图5C);在基因功能方面,cor-DEGs-DEPs主要富集在RAS、细胞凋亡和HTLV-I路径中(见图5D)。

构建DEGs和DEPs共表达网络(见图5E),由于网络使用degree度值和betweenness值构建,因此中心节点与其他基因之间的联系更紧密,提示可能在pSS诊断中发挥不可替代的功能作用。将DEP作为pSS生物标志物汇集并用于Cytoscape构建PPI网络分析。“CytoNCA”插件用于计算DEP之间的连接分数。此外,具有5个以上节点(degree≥5)被归类为核心蛋白,结果显示,PPI网络包括25个节点和48个边缘,连接得分最高的前8个核心蛋白是Fn1、Klk1b26、Klk1、Klk1b5、Klk1b3、LCN2、HPX和AGT(用更大的圆圈和更亮的颜色标志),这些核心蛋白可能在pSS致病过程中发挥重要作用。

3 讨论

pSS是一种多因素介导的自身免疫性疾病,其病理特征是淋巴细胞浸润、腺泡萎缩和涎腺纤维化改变,影响涉及大涎腺和小涎腺。T/B淋巴细胞是淋巴细胞病灶的主要成分[9]。ESS是通过在小鼠身上诱导出类似人类pSS疾病从而用于疾病机制研究的模型方法,在ESS模型的唾液腺中可检测到淋巴细胞浸润和腺泡萎缩。小鼠诱导干燥模型虽因人鼠的物种差异及组织器官免疫的不同反应性等,尚未能在小鼠模型上诱导出人类pSS的全部疾病特征,与人pSS关系仍有不确定性,但小鼠与人的遗传性高度相似,实验诱导ESS小鼠可出现类似pSS病人表现,如口干的外分泌腺损害及淋巴细胞浸润导致腺泡萎缩,因此广泛用于pSS疾病机制的研究[10-11]。

本研究探讨ESS的潜在分子机制,发现了可能用于预测其疾病进展的生物标志物,报道了转录组和蛋白质组数据集,并将其整合以揭示pSS的致病途径,从而能够在RNA和蛋白质水平上识别潜在的生物标志物及相关生物过程和信号通路。通过整合转录组学和蛋白质组学数据,蛋白质和mRNA水平之间的关联提供了翻译和蛋白质降解结果的信息。通过对pSS病人小唾液腺的全面转录组学分析,发现了与免疫反应相关的生物过程及相关的TAGAP和MCOLN2基因[12]。通过LC-MS/MS对pSS和非干燥对照受试者的全唾液、血浆和唇唾液腺组织样本进行分析,发现3种上调的唾液蛋白,能够将pSS病人与仅有pSS症状的病人区分开来,准确率为97%[13]。在本课题组前期研究[5]中,将ESS小鼠的唾液蛋白质组与对照组进行比较,确定了pSS的潜在生物标志物包括SERPING1、C3和CFH。这些发现可能有助于更早、更准确、更低成本地诊断pSS。多组学被认为是推进精准医学的关键,而具有一致转录和蛋白质水平趋势的基因可能是潜在的治疗靶点。

本研究中,发现27个DEGs-DEPs上调,其中包括一些关键基因。AGT作为RAS的前体分子,可在检测到局部RAS的颌下腺中表达[14]。KLKs是一种微小的血浆肽酶,也与pSS和实验性干眼症有关,然而尚不清楚哪种KLK亚型可以作为评估pSS严重程度和存在的标志物[15]。本研究发现几种KLK亚型表达水平异常,包括Klk1b26、Klk1、Klk1b5、Klk1b3和Klklb22。Klk1b22是一种分子抗原,可导致诱导性SS样疾病,其中健康动物用唾液或泪腺提取物免疫,并发展为干燥性角膜结膜炎,然而还需要更确凿的证据来确定Klk1b22与人类SS的相关性[16]。此外,根据SLE/pSS相关SNP的基因型,女性与男性相比,CTSB的表达受到不同调节[17]。有学者[18]发现,SS中LAMP3的过表达通过LAMP1降解抑制自噬,导致CTSB不当释放到细胞质中,最终导致细胞凋亡。这些发现支持LAMP3靶向治疗,以防止pSS中的细胞凋亡和炎症以及自身免疫的发展。

本研究还对一致的DEGs进行了GO和KEGG分析,其中GO分析显示主要富集在与细胞外相关部分。细胞外小泡已被确定为促炎介质,在感染和慢性炎症疾病期间促进炎症信号的释放。从全唾液和泪液中分离出的细胞外小泡可用于蛋白质组学分析,以筛选新的生物标志物,提高诊断准确性和跟踪疾病进展。这些结果为指导pSS的临床诊断和治疗干预提供了新的视角[19]。KEGG分析主要富集在RAS、凋亡和HTLV-I感染通路中。在正常泪腺组织和培养的泪腺成纤维细胞中检测到RAS成分ACE和AT1R,接受AT1R阻滞剂(ARB)后,泪液分泌增加。本研究中,在颌下腺中发现了局部RAS。RAS作用于稳态调节过程,血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂洛沙坦可减少唾液流量和蛋白质含量,同时,异丙肾上腺素治疗可提高颌下区AGT表达,主要影响位于腺泡[14]。有研究[20]进行KEGG分析显示,沙参麦冬汤可以改变RAS信号通路。研究[21]表明,以Fas/FasL系统为中心的促凋亡信号,以Bcl-2家族成员和/或EGF为中心的抗凋亡信号紧密控制SGEC凋亡。病毒可能是SS发病的原因和环境因素。HTLV-1是一种致癌逆转录病毒,可引发成人T细胞白血病或淋巴瘤,并与SS相关。最近发现了一种生物膜状结构,将HTLV-1转移到唾液腺上皮细胞(SGEC)并引起炎症,通过滤泡树突状细胞样细胞,HTLV-1感染细胞并抑制B淋巴细胞激活因子或C-X-C基序趋化因子13,表明HTLV-1对SS的直接影响[22]。

本研究存在局限性,因个体有差异性而分析中所用样本数量较少;差异表达基因及蛋白应在病人样本中得到验证。总之,本研究整合了唾液腺转录组和唾液蛋白质组探索了ESS的分子致病机制,揭示了ESS相关基因和蛋白质之间的潜在关系,聚焦特定的途径,包括RAS、细胞凋亡和HTLV-1感染,这有助于在未来研究中进一步探索pSS发病机制。