杨水艳,肖艳华,曾蓓,张明洁

(焦作市妇幼保健院 孕产保健科,河南 焦作 454000)

先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是指胎儿时期心血管发育异常或障碍导致的心血管畸形,是临床常见的出生缺陷性疾病[1]。CHD在出生缺陷中占比高达26.7%,在活产新生儿中的发病率高达0.8%～1.0%,是新生儿非感染性死亡的首要原因[2],严重威胁新生儿健康。基因组拷贝数变异(copy number variation,CNV)是指由基因组重排所致的长度1 000 bp以上基因片段的拷贝数增减,是遗传变异的重要因素,也是造成CHD的重要原因之一[3]。拷贝数变异测序(copy number variation sequencing,CNV-seq)技术是指基于高通量测序技术对样本DNA进行全基因组范围的低深度CNV测序[4],具有检测范围广、阳性检出率高、通量高、检测速度快、成本低、操作简便等优点,故而近年来被广泛应用于胎儿的产前诊断[5]。鉴于此,本研究特采用CNV-seq技术对中孕超声筛查出的胎儿CHD孕妇行遗传学病因诊断,以期为胎儿CHD孕妇的干预提供指导,提升生育质量。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2019年12月至2022年1月在焦作市妇幼保健院超声筛查出的77例胎儿CHD的中孕期孕妇作为研究对象,孕妇年龄21～39岁,平均(29.53±4.28)岁;初产妇59例,经产妇18例;孕周17～26周,平均(21.52±3.48)周。本研究经医院医学伦理委员会批准同意。(1)纳入标准:①为自然受孕、单胎孕妇;②孕周在14～27周;③经中孕期超声筛查诊断为胎儿CHD;④孕妇签署本研究知情同意书。(2)排除标准:①合并有严重的妊娠高血压、糖尿病、甲状腺功能障碍等疾病者;②胎儿宫内窘迫、阴道大出血者;③异位妊娠者;④有精神障碍疾病者;⑤具有宫内感染史、致畸物质接触史的孕妇。

1.2 超声诊断胎儿CHD的方法孕妇在孕中期(14～27周)时,采用彩色多普勒超声诊断仪(Voluson E10)进行CHD筛查。孕妇取仰卧位,二维超声探头频率调节至3～5 MHz,四维超声探头频率调节至2.0～6.0 MHz。先参考常规心脏诊断模式对胎儿腹部行横切,调整并获取胎儿标准四腔心切面,观察胎儿心脏位置、形态、大小是否正常,心房、心室间隔的完整性,二尖瓣与三尖瓣的形态、大小、位置是否正常,记录胎儿肺动脉、动脉管等发育情况与胎儿心律、心率。对孕妇行四维超声检查,以四腔心切面为初始平面,按照灰阶二位方式收集胎儿心脏房、室、腔、血管、血流等的声像信息。若发现异常,则通过超声心电图复查,由2名及以上主治医生共同确认。

1.3 胎儿CNV-seq检测在超声筛出的胎儿CHD孕妇知情并自愿行CNV-seq检测的前提下开展以下检查。(1)DNA提取:妊娠未终止者,超声引导下经腹羊膜腔穿刺抽取羊水5 mL,采用纯化柱法(QIAamp DNA Blood Mini Kit,德国QIAGEN公司)提取羊水细胞基因组DNA;流产胎儿取大腿内侧直径3 cm左右的皮肤肌肉组织,采用磁珠法提取试剂盒(Blood DNA Midi Kit D3494,美国OmegaBio-tek公司)与自动DNA提取设备(艾本德中国有限公司)提取DNA,操作流程严格按照说明书进行。(2)CNV-seq检测:使用商品化CNV检测文库构建试剂盒(北京贝瑞和康生物技术有限公司),通过本科室illumina测序平台NextSeq 500进行CNV检测,测序类型SE45(单端测序,读长45 bp),平均测序深度0.1X。人类基因组参考序列选择GRCh37[加州大学克鲁兹分校主办基因组检索数据库(UCSC),http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway],检测分析出分辨率为100 kb以上的CNVs。(3)CNV致病性分析:主要参考人群多态性数据库(DGV,http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、病例数据库(DECIPHER,http://decipher.sanger.ac.uk)和在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,http://omim.org),同时参考基因剂量效应数据库(ClinGen,https://www.ncbi.nim.nih.gov/projects/dbvar/clingen)分析拷贝数缺失、重复。CNV可根据性质分为良性、可能良性、不确定意义(variant of uncertain significance,VOUS)、可能致病性和致病性CNV[6]。

1.4 染色体核型分析在孕妇知情同意前提下,对行羊水穿刺检查的孕妇同时抽取羊水10 mL,离心收集胎儿羊水细胞并接种于5 mL羊水培养基上,置于含体积分数为5%二氧化碳的37 ℃恒温箱内培育5～7 d,获取细胞之前2 h加入秋水仙碱10 μL,随后依次经过低渗、固定、制片、G显带染色,常规分析30个分裂相,嵌合体分析50～100个分裂相。

1.5 妊娠结局随访对孕妇随访至妊娠终止或胎儿娩出,在孕妇知情同意的前提下,流产胎儿均通过尸体解剖诊断心脏状态,活产新生儿通过超声心动图检查心脏状态,上述诊断结果作为CHD诊断“金标准”。

2 结果

2.1 中孕期筛查胎儿CHD发生情况及妊娠结局中孕超声筛查的77例胎儿CHD的超声诊断结果见表1,其中室间隔缺损占比最高,孕妇均完成随访。其中13例选择直接流产,64例选择羊水穿刺,经随访此64例中最终有12例选择引产,52例选择继续妊娠。经尸检或活产后超声心动图检查发现有74例被证实为胎儿CHD,中孕超声诊断CHD的准确率为96.10%(74/77)。

2.2 染色体核型分析74例胎儿CHD孕妇中共有61例行羊水穿刺后染色体核型分析检查(37例在焦作市妇幼保健院检查,24例在外院检查)。共检出8例异常,检出率为13.11%(8/61)。其中有5例染色体数目异常:核型为47,XN,+18者2例;47,XN,+13者1例;45,X,del(18)者1例,47,XXY者1例;2例染色体异位:46,XN,t(4;7)(q31.1;q11.2)1例;46,XN,t(11;20)(q13;p11.2)1例;1例染色体倒位:46,XN,inv(4)(p15.2q31.1) 。典型染色体核型图见图1。

2.3 CNV-seq分析CHD胎儿CNV的结果74例胎儿CHD孕妇均行胎儿基因组CNV-seq检查,其中45例在焦作市妇幼保健院检查(37例行羊水穿刺后胎儿基因组CNV-seq检查,8例行流产后胎儿基因组CNV-seq检查),29例在外院检查(24例行羊水穿刺后胎儿基因组CNV-seq检查,5例行流产后胎儿基因组CNV-seq检查),共检出异常CNV 13例,检出率为17.57%(13/74),包括致病性CNV 11例,可能致病性CNV1例,VOUS 1例。其中61例行羊水穿刺染色体核型分析的孕妇胎儿基因组CNV-seq检查共检出11例CNV异常,包括10例致病性CNV(5例染色体数目异常、2例基因微重复、3例基因微缺失)、1例VOUS(基因微缺失),其中5例染色体数目异常与染色体核型分析结果一致;余13例仅在流产后行胎儿基因组CNV-seq检查的孕妇中共检出2例CNV异常,包括1例致病性CNV(基因微缺失)、1例可能致病性CNV(基因微重复)。见表2、3。典型的CNN-seq检测结果见图2。

表1 中孕超声诊断结果

a为47,XN,+18;b为47,XN,+13;c为45,X,del(18);d为47,XXY

表2 11例被羊水穿刺后CNV-seq检出基因CNV的CHD胎儿CNV-seq结果

表3 2例流产后CNV-seq检出基因CNV的CHD胎儿CNV-seq结果

A为6号染色体微缺失;B为16号染色体微重复;C为17号染色体微重复;D为22号染色体微缺失。

3 讨论

CHD是一类在胎儿中表现出高度异质性的先天性疾病,病因复杂,诊断困难,其中基因组CNV是其重要的致病因素之一[7]。CNV主要包括基因组缺失、插入、重复和复杂的多位点变异等表现形式,可通过扰乱基因活性、剂量、表达等方式导致CHD[8],尤其致病性CNV会造成胎儿不良预后,故在孕期对胎儿CHD孕妇做CNV筛查对预防出生缺陷具有重要的临床意义。目前,染色体核型分析仍然是CHD胎儿产前诊断的“金标准”,可检测出染色体的数目异常与大的结构变化,但由于其具有检测周期较长、漏诊率高、对10 Mb以下的微缺失/重复无法检出等不足,检测的局限性也比较明显[9-10],故探讨更准确高效的CNV筛查技术仍然是临床研究的重点方向。

超声检查是通过观察胎儿心脏的位置、形态、大小、结构、不同的切面构造、血流等方面的特征对胎儿心脏是否异常做出较为准确的判断,其为无创、安全、高效的孕期CHD筛查方法,在临床上应用广泛[11]。本研究对中孕超声诊断为胎儿CHD的77例孕妇随访到妊娠结局,其中有74例被证实为胎儿CHD,以ASD为主,超声诊断准确率为96.10%(74/77),略高于谢彩丽等[12]报道的92.17%的结果,分析原因,可能是由于不同孕周胎儿的心脏发育状态差别大,CHD特征在不同胎儿中的异质性较大,噪声信号造成伪像、母体的腹壁瘢痕、羊水量异常等因素干扰诊断,故超声诊断存在误诊现象[13]。

本研究显示,74例被证实为胎儿CHD孕妇中有61例行羊水穿刺后胎儿染色体核型检查,染色体核型检出8例异常,检出率为13.11%;74例被证实为胎儿CHD孕妇均进行了胎儿基因组CNV-seq检查者,共检测出13例CNV,检出率为17.57%(13/74),此与邓新娥等[2]报道的17.2%的结果相近。其中染色体数目异常5例,分别为13-三体综合征1例、18-三体综合征2例、克氏综合征1例、特纳综合征1例,均与染色体核型分析结果一致;基因组致病性CNV 6例,分别为22q11.2微缺失综合征2例,22q11.2微重复综合征、Williams综合征、16p13.11微重复综合征、6号染色体部分缺失各1例;可能致病性CNV 1例,17号染色体部分重复;VOUS者1例,3号染色体微缺失。此8例染色体微缺失/微重复者染色体核型分析技术均未检出。本研究发现上述常见的致病性综合征胎儿常伴有CHD,而其多由22q11.21的变异、染色体三拷贝等因素引发。陈晓等[14]报道22q11.21微缺失或重复常伴有室间隔缺损、永存左上腔静脉右位主动脉弓等,18-三倍体综合征常伴有室间隔缺损、单心房等;汪敏等[15]表明18-三体综合征常伴有法洛四联症、心室发育不良等。上述报道与本研究均证实了CNV在CHD发病中的致病作用,故产前对胎儿的CNV进行筛选具有重要的临床意义。CNV-seq技术是基于下一代测序技术的基因测序手段,其相较于传统的核型分析技术而言,其诊断的分辨率更高,可以检测到核型分析无法检测到的微小基因重复或缺失,也可以规避核型分析时由于细胞培养失败所致的CNV无法检测的情况,提升检出率,临床上常将其与核型分析结合,不仅使得国内目前产前诊断供给严重不足的状况得以缓解,也为核型分析结果提供了有效的补充,提升CNV的整体检出率[16-17]。CNV-seq技术相较于传统的荧光原位杂交技术而言,在流产物中检测CNV的检出效率更高[18];相较于效率、精度、成功率等与自身相当的染色体微阵列分析技术而言,更加节约成本,经济效益更好,更便于推广应用[19]。但CNV-seq技术也存在明显的缺点,其无法检测出染色体中发生的易位、倒位等染色体平衡性结构重排的现象,无法检测单基因与极小基因片段异常引发的单基因病等,无法区分易位型与游离型三体,故必要时需与其他检测手段结合提升诊断准确率[20]。

综上,本研究通过对比中孕超声筛查出的胎儿CHD孕妇染色体核型分析与CNV-seq分析结果,明确了两项技术的优势与不足,建议临床上对疑似胎儿CHD做羊水穿刺,行染色体核型分析,同时行CNV-seq检测提高微小基因重复或缺失检出率,以期明确胎儿CHD遗传学病因,指导伴有致病CNV胎儿的孕妇做出正确妊娠选择,为产前咨询与胎儿预后提供可靠参考,进而减少出生缺陷,提升生育质量。