李金龙

单核细胞是机体固有免疫系统的重要组成,作为首道防线维持机体内环境稳态。研究发现,单核细胞具有异质性。根据单核细胞表面标志物的差异,将人类单核细胞分为经典型、中间型、非经典型3 个亚群［1］,将小鼠单核细胞分为Ly6Chi和Ly6Clo两个亚群［2］。近年来发现,单核细胞亚群比例失衡和功能失调是众多炎症相关疾病发生发展的重要病理生理学基础之一［3］。2007 年,Nahrendorf 等［4］第一次发现小鼠单核细胞不同亚群的比例在小鼠急性心梗后出现动态变化：Ly6Chi单核细胞比例在小鼠急性心梗后迅速增加,在第 3 d 达到高峰,随后开始下降；后续研究显示,急性心梗后继发的Ly6Chi单核细胞增多与心梗后心室重塑和心功能恶化有关。Zhou 等［5］发现小鼠心肌梗死后第3 d 外周血 Ly6Chi单核细胞增加至70%以上,使用多粘菌素可降低炎症反应及Ly6Chi单核细胞比例。陈羽斐等［6］发现麝香保心丸通过减少循环中炎性单核细胞比例和斑块中巨噬细胞含量,调控动脉粥样硬化斑块的炎症反应。然而,不同研究中报道的Ly6Chi单核细胞亚群的比例不尽相同,对于标本的采集及处理也没有统一的规范。本研究发现,不同取血方式下流式细胞术测定小鼠外周血单核细胞亚群比例差异明显,采用下颌静脉丛取血方式与国内外文献多数报道最为接近。在涉及小鼠单核细胞亚群比例的研究中,应采取一致的采血方式。

1 材料与方法

1.1 一般材料 选择18 只6 周龄雄性C57BL/6J 小鼠,购自解放军军事医学科学院实验动物中心。体重在14～17 g 之间,适应性喂养7 d 后进行随机编号。喂养环境：室温25℃左右,每天日光灯给光12 h,相对湿度55%～65%。抗CD11b-PE、抗Ly6G-PerCP/Cy5.5、抗Ly6C-FITC 购自美国Sigma 公司。本研究通过滨州医学院附属医院实验动物伦理委员会审(N02021-Z021-11)。根据编号将小鼠随机分为乙醚麻醉+下颌静脉丛取血组、下颌静脉丛取血组、乙醚麻醉+摘眼球取血组,每组6 只。三组小鼠一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。见表1。

表1 三组小鼠一般资料比较()

表1 三组小鼠一般资料比较()

注：三组比较,P＞0.05

1.2 方法

1.2.1 取血方法 三组小鼠通过相应取血方式采取外周血。乙醚麻醉+下颌静脉丛取血组：用剪刀剪掉小鼠颌下毛发。乙醚麻醉后用5 ml 注射器针头垂直刺入下颌静脉,取血0.2 ml,滴入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝剂的 EP 管内,轻轻颠倒,使全血与抗凝剂混匀。下颌静脉丛取血组：取血前不进行乙醚麻醉,其余具体取血方法同乙醚麻醉+下颌静脉丛取血组。乙醚麻醉+摘眼球取血组：乙醚麻醉后用消毒的镊子摘取眼球后取血0.2 ml,滴入含有 EDTA 抗凝剂的 EP 管内,轻轻颠倒,使全血与抗凝剂混匀,后小鼠脱臼处死。

1.2.2 样品制备 三组小鼠采取外周血后,在流式管中用同一微量移液器依次加入8.1 μl cell staining buffer、1.0 μl 抗Ly6G-PerCP/Cy5.5、0.7 μl 抗CD11b-PE、0.2 μl 抗Ly6C-FITC,然后加入30 μl 血液标本,混匀,置于22℃暗箱中孵育15 min,孵育结束后加入红细胞裂解液600 μl(提前30 min 从冰箱中取出恢复室温),混匀后22℃暗箱孵育10 min,孵育结束,涡旋器涡旋后上机检测［7］。

1.2.3 上机检测 流式细胞仪先用装有超纯水的流式管清洗2 次,打开预先设定的程序,依次检测标本。侧向散射光(side scatter,SSC)代表细胞的复杂性,以其为纵坐标,以Ly6G-PerCP/Cy5.5 荧光强度为横坐标,不同种类的细胞将会以散点图的形式出现在界面上。细胞被大致分为三群,Ly6G 主要表达于粒细胞表面,因此单核细胞存在于SSC 较低和Ly6G 荧光强度较弱的细胞群中,设门后将淋巴细胞和粒细胞去除。在下一步中,仍选择SSC 为纵坐标,CD11b-PE 荧光强度为横坐标,由于CD11b 主要在单个核细胞中表达,因此CD11b 表达较强的单核细胞可被分离出来。选择Ly6C-FITC 荧光强度为纵坐标,SSC 为横坐标,根据Ly6C 荧光强度强弱的不同,即可显示出不同亚群单核细胞的比例。在本实验中,将小鼠外周血单核细胞划分为两群,分别是Ly6Chi和Ly6Clo单核细胞。流式细胞术分离单核细胞亚群的过程见图1 所示。应用FlowJo7.6.1 程序和CXP 程序分析每组数据,得到各组不同单核细胞亚群的比例［7］。

图1 小鼠外周血单核细胞亚群设门方法

1.3 观察指标 比较三组小鼠外周血Ly6Chi单核细胞亚群比例。

1.4 统计学方法 采用GraphPad8.3.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用单因素测量方差(one-way ANOVA)分析,组内两两比较使用 Bonferroni 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

三组小鼠外周血Ly6Chi单核细胞亚群比例比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。乙醚麻醉+摘眼球取血组小鼠外周血Ly6Chi单核细胞亚群比例(60.1±1.4)%明显高于乙醚麻醉+下颌静脉丛取血组的(51.1±2.1)%,差异有统计学意义(P＜0.01)。下颌静脉丛取血组小鼠外周血Ly6Chi单核细胞亚群比例(57.1±1.5)%高于乙醚+下颌静脉丛取血组的(51.1±2.1)%,但差异无统计学意义(P＞0.05)。乙醚麻醉+摘眼球取血组与下颌静脉丛取血组小鼠外周血Ly6Chi单核细胞亚群比例比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图2 流式细胞术检测各组Ly6Chi 单核细胞亚群

3 讨论

单核细胞作为一种重要的免疫细胞,来源于骨髓,在血液中循环数天,分化为巨噬细胞和树突状细胞,参与病原微生物吞噬、抗原呈递、T 细胞功能调节等重要过程,在无菌性及感染性炎症疾病的生理病理进程中发挥重要作用［8,9］。单核细胞具有异质性,1989 年Ziegler-Heitbrock 利用单克隆抗体结合双色流式细胞技术,第一次证实人外周血中存在CD14+CD16-和CD14+CD16+两种单核细胞亚群。目前人类单核细胞分为经典型、中间型、非经典型3 个亚群［10］,小鼠单核细胞分为Ly6Chi和Ly6Clo两个亚群［11］。近年来,人们对不同单核细胞亚群在疾病中的作用开展了许多研究。

目前对于单核细胞亚群的分类主要基于流式细胞术。本研究发现,在小鼠的单核细胞亚群研究中,不同的取血方式对相应结果的测定有影响,会导致结果的偏倚。应用乙醚麻醉小鼠后取下颌静脉丛进行测定Ly6Chi单核细胞的比例在51%左右,应用乙醚麻醉小鼠后摘眼球取血测定值为60%左右,造成这种差别的原因可能与取血量以及应激有关。麻醉状态以及下颌静脉取血相对创伤较小,而应激状态及特殊因素暴露均会引起单核细胞亚群表型的偏移。单核细胞在炎症状态下可以由骨髓迁移至外周,也可以分化为其他免疫细胞如巨噬细胞和树突状细胞,所以单核细胞长期处于动态平衡的状态,对周边环境的变化反应迅速。炎症及多种趋化因子受体可控制单核细胞由骨髓迁移至外周,并分化为不同的单核细胞亚群。然而,目前尚不清楚不同单核细胞亚群之间的相互转化的具体机制［12］。Nahrendorf 等［4］发现小鼠Ly6Chi单核细胞比例在小鼠急性心肌梗死后第3 天增加到高峰,随后开始下降。高脂饮食会导致ApoE-/-小鼠Ly6Chi单核细胞明显增加［13,14］。杨英杰等［15］发现,4 Gy γ 射线照射小鼠后第3 天外周血Ly6C+亚群比例显著升高至90%。此外,李子安等［16］发现不同的样本保存方式会影响流式细胞术检测淋巴细胞亚群结果。栾正云等［17］发现单核细胞亚群检测分析时易受标本放置时间的影响,标本采集后应尽快检测,采集后4 g 内对检测结果影响不大。这都提示不同环境以及处理方式会影响单核细胞亚群比例的测定。

Blood 发表的单核细胞亚群分型的国际共识中并没有界定小鼠各分型的具体比例。Nahrendorf 等［4］发现小鼠Ly6Chi单核细胞比例在小鼠急性心肌梗死后第3 天从基线值55%左右达到75%,国内研究中,高脂饮食3 d 时C57BL/6J 小鼠Ly6Chi比例为40%［18］。杨英杰等［15］检测到正常BALB/c 小鼠外周血Ly6C +亚群占总单核细胞比例约为55%,Ly6C +亚群的比例约为45%。张芯等［19］对C57BL/6J 脑梗小鼠模型以及向国安等［20］对小鼠矽肺模型的研究中,基线Ly6Chi亚群占总单核细胞比例约为55%和57%。对比本研究结果提示,在进行小鼠外周血单核细胞亚群的实验研究中,下颌静脉取血的结果与国内外文献报道最为接近。然而,本研究未能应用流式分选技术将外周血 Ly6Chi单核细胞分离,进一步研究不同取血方式导致结果差异的确切机制。

综上所述,不同取血方式对小鼠外周血单核细胞亚群比例测定有差异,在涉及小鼠单核细胞亚群比例的研究中,应采取一致的取血方式。