王熙滢，吴 点，刘雅杰，汪 鹏，王平航，胡长玉

（黄山学院生命与环境科学学院，安徽屯溪 245041）

如今，食品的健康问题越来越受人们的关注，对健康的质量要求也变得越来越高[1]。红茶富含茶多酚、茶色素、茶多糖、茶蛋白、茶氨酸和咖啡因等功能成分，具有抗肿瘤、抗突变、抗衰老、抗疲劳、抗辐射、抗龋齿、消除重金属毒害、代谢调节和生理调节、美容、抑制有害微生物、增强记忆及改善大脑功能等[2]医疗保健功效。

咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，具有提神和抗疲劳效果，是世界上使用最普遍的中枢神经兴奋剂。目前，消费品市场上咖啡、茶、软饮料及能量饮料十分畅销的原因也是因为含有咖啡因成分[3]。咖啡因作为茶叶中的主要呈味物质之一，咖啡占茶叶干物质总含量的2%~5%[4]。经常摄入高剂量的咖啡因会刺激中枢神经、影响睡眠、增加血压、提高类风湿关节炎的患病率、引起婴儿早产等[5-8]。对于儿童、哺乳期妇女及某些病患者来说，茶叶中的咖啡碱成了他们望茶生畏的主要原因[9]。因此，如何尽可能地脱除红茶中咖啡因具有一定的研究价值。

目前，脱咖啡因技术主要有水脱除、溶剂萃取、吸附分离和超临界CO2萃取等传统方法，以及后来发展的微生物和酶法降解咖啡因、培育低咖啡因茶树等[10]。研究表明，对于茶鲜叶、蒸青叶或萎凋叶在85 ℃的热水中快速浸取1 min，咖啡碱脱除率达71%，浸取3 min 后，咖啡碱的脱除率达83%，说明提高浸取时间可能会提高咖啡碱脱除率[11]。研究表明，加温2~3 min，热水温度从80 ℃上升到90 ℃[12]，咖啡碱的脱除率可以从60.51%提高到72.26%，以1∶20 的茶水比于100 ℃下浸泡3 min，可脱除83%的咖啡因，而鲜叶中保留了95%的儿茶素。由于热水高温处理会导致茶鲜叶中多酚氧化酶失活，在揉捻及发酵酶活性难以达到制作红茶要求[13-14]，为了提高红茶中咖啡因脱除率，保持红茶品质，以红茶为研究对象，通过单因素试验及响应面试验优化制作低咖啡因红茶工艺，并对其品质进行分析，旨在为低咖啡因红茶的制作工艺提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶鲜叶，谷雨前购于休宁荣山茶厂；多酚氧化酶（食品级生产批号21096582 酶活度10 000 U/g），青岛隆川生物科技有限公司提供。

盐酸、咖啡因、氧化镁、甲醇（分析纯），太仓沪试试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

手提式万能粉碎机，济宁凌琛机械设备有限公司产品；发酵箱，广州市尼科机械设备有限公司产品；QYGDW-s10a 型真空干燥箱，上海琦意工业设备有限公司产品；高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司产品；电子分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公公司产品；恒温水浴锅，上海声彦超声波仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

低咖啡因红茶工艺流程图见图1。

图1 低咖啡因红茶工艺流程图

1.3.2 操作要点

（1） 萎凋。将采摘的鲜叶在15~23 ℃下萎凋6~8 h，摊叶厚度12~15 cm ，翻叶频次2 h /次，得到萎凋叶。

（2） 热水浸提、脱水。将萎凋叶浸泡在一定温度的水中一定时间后捞出脱水得到处理叶。

（3） 加酶。用一定浓度的多酚氧化酶液喷洒处理叶，表面湿润为宜，空白组喷洒蒸馏水。

（4） 揉捻。将萎凋叶与处理叶按一定比例混合揉捻0.5 h，从同一个方向先空揉再加压，成块后抖开再重复之前操作，利于保持芽叶完整性。

（5） 发酵。将经揉捻处理的二次处理叶置于温度30 ℃的恒温发酵室，摊叶厚度6~8 cm，保持湿度95%以上发酵5 h。

（6） 干燥。用烘干机分2 次烘干。在第1 次烘干结束后，待茶叶冷却回潮后再进行第2 次烘干。

（7） 筛分。用4.5 目和14 目的平圆筛机对毛茶的头脚进行分拣，除去过大的头茶和过小的碎茶。利用风力通过风力分离器去除淡黄色片状、碎片等。

（8） 挑拣。主要为人工挑拣。挑去红茶中风选后留下的红片、红筋、黄片等影响红茶品相的低等茶。

（9） 提香。于70~80 ℃条件下提香2 h。

1.4 咖啡因脱除率的测定

1.4.1 标准曲线的绘制

（1） 标准液的制备。称取咖啡因125 mg（纯度不低于99%），按1∶4 的比例加入乙醇和蒸馏水，溶解并定容至250 mL，摇匀，相当于每1 mL 标准储备溶液含0.5 mg 咖啡因，吸取1.0，2.0，5.0，10.0 mL 上述标准储备液，分别加蒸馏水定容至50 mL 作为系列标准工作液，每1 mL 该系列标准储备液中，分别相当于含10，20，50，100 μg 咖啡碱。

（2） 处理液的制备。称取1.0 g 的制备的红茶样叶，磨碎后置于500 mL 烧杯中，加入氧化镁4.5 g，加入300 mL 沸水，沸水浴加热20 min，每隔5 min晃动烧瓶摇匀。沸水浴完成后，立即转入抽滤机中进行过滤，将滤液移入500 mL 容量瓶中，冷却后用蒸馏水定容，混匀制成处理液待测。

（3） 绘制标准曲线。取适量咖啡因标准液置于HPLC 进样瓶中，分别以咖啡因标准液质量浓度为5，10，25，50 μg/mL，按照高效液相色谱条件为检测波长：紫外检测器，波长280 mm；流动相：取600 mL 甲醇加入1 400 mL 蒸馏水，混匀，过0.45 μm膜；流速0.5~1.5 mL/min，柱温40 ℃，进样量10~20 μL 进行测定。以咖啡因标准液质量浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，得到标准曲线的回归方程为：Y=96.892X+523.64（R2=0.992 7）。

1.4.2 咖啡因含量的计算方法

参照GB/T 8312—2013，对标准样品和处理样品的峰面积进行定量，将茶叶中咖啡因的含量表示为干态质量分数，再根据标准曲线测定咖啡因含量，计算方法如下：

式中：C1——根据标准曲线上计算得出的测定液中咖啡碱质量浓度，μg/mL；

V1——样品总体积，mL；

m——试样的质量，g；

ω——试样干物质含量（质量分数），%。

1.4.3 咖啡因脱除率的计算

1.4.4 感官评分的测定

按照国标GB/T 23776—2018，从干茶外形、香气、滋味、叶底和汤色5 个方面对茶叶进行专业品评，采用百分制评分。

茶叶感官评分标准见表1。

表1 茶叶感官评分标准

1.4.5 产品品质指标的测定

氨基酸含量：按GB/T 8314—2013《游离氨基酸总量的测定》执行。

总糖：采用蒽酮比色法测定总糖的含量。

1.5 单因素试验设计

1.5.1 浸提温度对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

按照1.3.1 的工艺流程，按萎凋叶与处理叶比例1∶2 制作红茶，其中处理叶按固定热水浸提时间30 s，多酚氧化酶添加量2%，考查烫漂温度（50，60，70，80，90 ℃） 对制作完成后的红茶咖啡因脱除率以及感官评分的影响。

1.5.2 浸提时间对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

按照1.3.1 的工艺流程，其中固定热水浸提温度70 ℃，萎凋鲜叶与处理叶质量比为1∶2，多酚氧化酶添加量2%，考查热水浸提时间（0，15，30，45，60 s） 对红茶咖啡因脱除率以及感官评分的影响。

1.5.3 萎凋鲜叶与处理叶的质量比对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

按照1.3.1 的工艺流程，其中固定热水浸提时间30 s，热水浸提温度70 ℃，多酚氧化酶添加量2%，考查萎凋鲜叶与处理叶质量比（0∶1，1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4） 对红茶咖啡因脱除率以及感官评分的影响。

1.5.4 多酚氧化酶添加量对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

按照1.3.1 的工艺流程，固定热水浸提工艺条件为温度70 ℃，萎凋鲜叶与处理叶质量比为1∶2，浸提时间30 s。在茶堆上喷洒多酚氧化酶溶液后进行揉捻，探讨不同添加量（0，2%（酶活度200 U/g），4% （酶活度400 U/g），6% （酶活度600 U/g），8%（酶活度800 U/g）） 的多酚氧化酶液对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响。

1.6 响应面试验优化

以单因素试验结果为参考，采用Box-behnken中心组合试验设计原理，选取浸提温度（A）、浸提时间（B）、萎凋鲜叶与处理叶的质量比（C） 3 个因素作为自变量，以咖啡因脱除率为评价指标。分别以A、B、C 为代表，将每一个自变量的低中高试验水平分别以-1，0，1 进行编码，将咖啡因脱除率（Y） 记为响应值，采用三因素三水平试验设计，优化低咖啡因红茶加工工艺。

响应面试验设计的因素与水平设计见表2。

表2 响应面试验设计的因素与水平设计

1.7 数据处理

所得试验数据为3 次重复试验所得数据的平均值。Excel 2016 用于数据统计，Origin pro 2018 用于数据绘制，Expert-Design 10.0 用于响应面优化分析、回归模型方差分析和显着差异分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 浸提温度对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

浸提温度对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响见图2。

图2 浸提温度对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

由图2 可知，随着温度的升高咖啡因脱除率呈现先升高后降低的趋势，在70 ℃达到最大值51.82%±1.41%。因为随着温度的提升，咖啡因会在热水中迅速溶解、浸出，使得茶叶中的咖啡因含量不断减少，脱除率升高[15]。但是，当温度高于70 ℃时，咖啡因脱除率变化不显著，同时高温会使多酚氧化酶失活，从而使儿茶素不能被氧化成茶红素，使红茶色泽受到影响，造成红茶感官评分下降。综合考虑，选择70 ℃作为浸提温度是较适宜的。

2.1.2 浸提时间对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

浸提时间对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响见图3。

图3 浸提时间对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

由图3 可知，随着浸提时间的增长，红茶咖啡因脱除率及感官品质呈现先升高后降低的趋势，在30 s 达到最大值。可能因为在一定的时间内，咖啡因会在热水中迅速浸出，咖啡因脱除率不断升高，一旦时间过长，茶叶由于升温收缩，导致茶叶中的咖啡因脱除率下降。同时，随着浸提时间的延长，茶汤颜色变深，影响其感官品质，因此浸提时间不是越长越好，浸提时间30 s 较为适宜。

2.1.3 萎凋鲜叶与处理叶的质量比对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

萎凋鲜叶与处理叶的质量比对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响见图4。

图4 萎凋鲜叶与处理叶的质量比对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

由图4 可知，萎凋鲜叶和处理叶的质量比对红茶咖啡因脱除率和感官评分存在显著性影响（p<0.05）。咖啡因脱除率随着萎凋鲜叶和处理叶质量比的增大出现逐渐升高的趋势，因为鲜叶中咖啡因很容易从热水浸出，咖啡因的脱除率与处理叶的量密切相关。但是随着处理叶质量的增加，感官评分呈下降趋势，因此，萎凋鲜叶和处理叶的质量比确定为1∶2 较为合适。

2.1.4 多酚氧化酶添加量对感官评分和咖啡因脱除率的影响

多酚氧化酶添加量对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响见图5。

图5 多酚氧化酶添加量对红茶咖啡因脱除率及感官评分的影响

红茶中的茶黄素具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗癌等多种生物活性功能。由图5 可知，多酚氧化酶添加量高于2%时对红茶咖啡因脱除率的影响不显著。研究表明，多酚氧化酶会降解茶叶中的咖啡因，使得咖啡因的脱除率上升，但是随着多酚氧化酶添加量的增加，咖啡因脱除率变化不显著。综上所述，添加2%的多酚氧化酶较为适宜。

2.2 响应面优化结果分析

综合单因素试验结果，为了优化咖啡因的最大脱出率，选取浸提温度（A）、浸提时间（B）、萎凋鲜叶∶处理叶（C） 为自变量，以咖啡因脱除率为指标进行三因素三水平Box-behnken 响应面试验设计。

Box-behnken 试验结果见表3。

表3 Box-behnken 试验结果

用Design Expert 软件对表3 中数据进行分析，得到三因素与咖啡因脱除率之间的二次多项回归模型方程为：

2.2.1 响应面试验方差分析

模型回归方程及方差分析见表4。

表4 模型回归方程及方差分析

由表4 可知，模型p<0.000 1，呈现出极显著差异，说明回归模型对咖啡因脱除率具有很好的预测性。模型决定系数R2=0.995 3>0.95，模型修正决定系数R2Adj=0.989 2，说明回归模型可信度高，并且与实际试验所得数据拟合情况较好，呈现高度相关性；失拟项p=0.387 3>0.05，不显著，说明模型研究以外的因素对咖啡因脱除率的影响较小。单因素A、C、AB、AC、A2、B2、C2对咖啡因脱除率的影响极显著（p<0.01），B、BC 影响不显著（p>0.05）。由显著性检验F、p 值的大小得出各因素对咖啡因脱除率影响的顺序为萎凋鲜叶与处理叶质量比（C） >浸提温度（A） >浸提时间（B）。综上所述，可以用该模型回归方程分析和预测咖啡因脱除率工艺的结果，具有一定的实用性。

2.2.2 响应面面图分析

各因素的交互作用显著情况，可根据曲面图进行分析，曲面的倾斜程度与显著性呈正相关。响应面图显示了浸提温度、浸提时间、萎凋鲜叶与处理叶质量比三因素之间的交相互作用对咖啡因脱除率的影响。采用Design Expert 11 软件对影响红茶咖啡因脱除率的3 个因素进行交互分析。

各因素交互作用对红茶咖啡因脱除率的影响响应面图见图6。

图6 各因素交互作用对红茶咖啡因脱除率的影响响应面图

3 个响应因素与红茶咖啡因含量之间形成的响应曲面坡度均较陡，表明该3 个因素对咖啡因脱除率的影响较大，同时随着浸提时间、浸提温度和萎凋鲜叶与处理叶质量比的增加，红茶的咖啡因脱除率先下降后上升。等高线呈椭圆形，表明所研究因素之间的交互作用显著。AC 两因素的倾斜程度最大，BC 两因素的倾斜程度次之，AB 两因素倾斜程度最小，表明浸提温度和萎凋鲜叶与处理叶的质量比这2个因素之间对红茶咖啡因脱除率的交互影响最显著。

2.2.3 最佳工艺条件确定及验证试验

依据Design Expert 11 软件，以咖啡因脱除率为指标，将模型进行最优分析，确定低咖啡因红茶最佳生产工艺参数为热水浸提温度71.57 ℃，浸提时间29.25 s，萎凋鲜叶∶处理叶质量比1∶2.133 7（g∶g），此时的咖啡因脱除率为52.87%。考虑到实际情况，将最佳工艺参数修正为72 ℃，浸提时间为30 s，萎凋鲜叶∶处理叶质量比为1∶2（g∶g），在此条件下进行验证试验，所得红茶的咖啡因脱除率为53%，与模型预测值接近，证明工艺参数具有准确性，试验的优化条件可行。

2.2.4 红茶品质分析

不同处理方式对红茶品质的影响见图7。

图7 不同处理方式对红茶品质的影响

由图7 所知，对照组、热水浸提处理、热水浸提+多酚氧化酶处理对红茶感官品质、总糖、咖啡因含量及氨基酸含量产生了不同程度的影响。热水浸提处理组与对照组相比，红茶的感官品质有所提升，总糖含量、氨基酸含量及咖啡因含量均降低。采用热水浸提+多酚氧化酶处理可提高红茶总糖及氨基酸含量，改善红茶感官品质，降低红茶咖啡因含量。热水浸提处理和热水浸提+多酚氧化酶处理对红茶咖啡因含量影响不显著，两者咖啡因含量相比于对照组分别下降了51%，51.6%。因此，热水浸提+ 多酚氧化酶处理不仅可以改善红茶感官品质，提高总糖、氨基酸含量，还显著降低了咖啡因含量，在此条件下红茶咖啡因含量仅为1.58%，符合低咖啡因红茶的标准。

3 结论

以茶鲜叶作为原料，以红茶中咖啡因含量为响应值，通过单因素试验和响应曲面法确定低咖啡因红茶制作的最佳工艺参数为浸提温度72 ℃，浸提时间30 s，萎凋鲜叶与处理叶质量比为1∶2（g∶g），多酚氧化酶添加量为2%，在此最优条件下制备的红茶咖啡因脱除率为53%，咖啡因含量为1.58%，氨基酸含量为0.36%，总糖含量为2.82%。所制作的低咖啡因红茶外形较为较细紧，尚乌润，尚匀整，净度尚好，具有纯正的香气和香醇的滋味，叶底尚嫩，多筋，尚红亮，且茶汤色泽尚红亮。