史丽颖,温泽宇,宋 昱,于大永

(大连大学生命科学与技术学院,大连 116622)

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,患病率约占世界总人口的1%[1]。RA发病的起始部位是关节滑膜,滑膜成纤维细胞是RA炎症反应的主要效应细胞之一,其与T细胞的相互作用是参与RA发病的主要机制。RA通常会导致一些临床症状,如关节发热、肿胀和疼痛,RA晚期患者的骨关节变形破坏严重,有着较高的致残率[2-3]。目前针对RA治疗的一线药物包括抗风湿药、糖皮质激素和生物制剂等。化学药物治疗可以很快地缓解症状,但其毒副作用给身体带来很大的负担,而生物制剂等药物价格又十分昂贵。

RA在中医上属“痹症”,中医在治疗痹症上有着丰富的经验。中医认为RA是由于体质虚弱、气血两虚、肝肾亏损和风寒湿邪侵袭,使得筋脉痹阻[4]。麻黄-桂枝药对源于经典名方麻黄汤。草麻黄(麻黄)和云母肉桂(桂枝)作为君药和臣药相互促进,以3∶2的质量比组合后,可用于治疗气喘、鼻子及肺部充血、发烧多汗症和关节痛等风寒表实证者[5]。同时麻黄与桂枝均具有抗炎活性,桂枝还可协同麻黄发挥抗炎效果。另外,麻黄附子细辛汤合桃红四物汤加味与甲氨蝶呤联用,可有效缓解关节肿胀、关节疼痛和晨僵等临床症状[6]。有研究[7]表明,槲皮素作为麻黄的主要活性成分可下调体内TNF-α,从而促进伤口愈合并阻止体内炎症级联反应。麻黄附子细辛汤可降低树突状细胞表面共刺激因子和Th1型细胞因子的表达水平,从而抑制LPS诱导的树突状细胞分化成熟[8]。桂枝芍药知母汤在临床上也被用于治疗RA,在与甲氨蝶呤联合用药后,C反应蛋白表达量、类风湿性因子含量及红细胞沉降率均明显降低[9]。将桂枝芍药知母汤用于大鼠Ⅱ型胶原性关节炎模型中发现,其降低了大鼠脚趾肿胀、关节炎评分及血清 TNF-α、IL1β、IL6、IL17a水平,体外细胞实验表明桂枝芍药知母汤能上调Caspase-3、Caspase-9、Bax和SOCS1的mRNA表达,且下调 Bcl-2、JAK2、STAT3和STAT5的mRNA 表达,进而显著抑制TNF-α刺激的MH7A细胞的增殖且促进其凋亡[10]。

本研究基于网络药理学方法,从中药复方多组分、多靶点和多效应的作用特点出发,依据RA致病机制,探究麻黄-桂枝药对中的活性成分治疗RA的机制。研究整合了麻黄-桂枝药对中的活性组分与RA相关通路之间的信息,利用网络药理学的研究方法弥补了单成分、单靶点、单通路研究的不足,为从多靶点、多途径阐述麻黄-桂枝药对治疗RA的作用机制提供了可能。最后,采用分子对接方法分析了中药活性成分潜在的治疗靶点,以期为RA治疗提供理论依据。

1 实验方法

1.1 麻黄-桂枝有效成分及靶点筛选

运用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)(http：∥tcmspw.com/tcmsp.php)分别检索麻黄与桂枝中的有效成分,检索有效成分时设置口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18。同时,对有效成分的候选靶蛋白在TCMSP平台进行全方位检索。将数据制成表格,利用Cytoscape 3.8软件进行视图分析,并绘制药材-有效成分-靶点网络图。

1.2 类风湿性关节炎相关靶点检索

在GeneCards数据库(https：∥www.genecards.org/)中,以“rheumatoid arthritis”为关键词,检索RA的相关靶点。利用Venny 2.1.0软件将RA相关靶点映射到有效成分候选靶点,并取二者的交集绘制韦恩图。将交集靶点对应的有效化合物进行统计,然后利用Cytoscape 3.8软件计算其相关拓扑数据并构建药材成分-交集靶点网络图。

1.3 交集靶点PPI分析

为了进一步明确交集靶点在RA治病机理的蛋白-蛋白相互作用(PPI),将交集靶蛋白的Gene ID导入STRING数据库(https：∥string-db.org/),模式选择“multiple proteins”,蛋白种属设为“homo sapiens”,筛选条件为“medium confidence(0.900)”,得到交集靶点相互作用网络数据,并将该数据导入Cytoscape 3.8软件,从而制作蛋白互作(PPI)网络图。对PPI网络图进行相关的拓扑数据分析后,依据Cytoscape 3.8软件中的degree值选取关键靶蛋白。

1.4 KEGG 通路富集分析和 GO 富集分析

了解核心靶蛋白的生物功能以及参与的信号通路,对从分子机制上分析麻黄-桂枝药对治疗RA是十分关键的。将核心靶蛋白的Gene ID导入David 6.8 数据库(https：∥david.ncifcrf.gov/),对核心靶点蛋白在生物过程(Biological Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)方面的作用机制以及KEGG通路富集进行分析。

1.5 构建药材-成分-靶点-信号通路网络图

将核心靶点及其对应的化合物、信号通路的数据导入Excel表格,对数据进行整理后导入Cytoscape 3.8软件进行视图分析,从而绘制药材-成分-靶点-信号通路网络图。对网络图进行拓扑数据分析后,依据Cytoscape 3.8软件中的degree值选取在关键通路中发挥作用的核心靶点,然后对核心靶点及核心化合物进行分子对接实验。

1.6 分子对接

所有核心蛋白的晶体结构均从PDB数据库(https：∥www.rcsb.org/)获取,本次模拟分析均在Schrödinger 2019软件中完成。在“Protein preparation wozard”模块下对蛋白晶体结构进行预处理,包括加氢、添加缺失的氨基酸残基以及对蛋白结构进行能量最小化。在Glide模块中,为了确保对接准确性,选取对接精度为精确对接(XP),定义活性口袋方法均采用配体扩张法,以蛋白晶体结构中共晶化合物所在蛋白口袋为活性位点,对接方式采取半柔性对接,通过对接分数值(Docking score)来判断活性成分与靶点之间是否存在潜在的阳性作用。在对接实验前,在Glide模块中对共晶化合物进行重对接,将对接产生的构象与原晶体构象叠合后计算均方根偏差(RMSD)。若RMSD数值小于0.2 nm,则证明对接方法较合理[11]。

2 结果与分析

2.1 麻黄-桂枝药对中的活性成分及靶点的筛选结果

在TCMSP数据平台上分别对麻黄与桂枝中的活性成分进行筛选,麻黄中符合筛选条件的化合物共22个(MH1～MH19,A1～A3),桂枝中符合筛选条件的化合物共6个(GZ1～GZ3,A1～A3),2种药材中的共同活性成分有3个(A1～A3),由此确认麻黄-桂枝药对中的活性成分共25个(表1),检索到对应候选靶点229个,由此绘制药材-活性成分-靶点网络图(图1)。

图1 药材-活性成分-靶点网络Figure 1 The network of medicinal materials-active ingredients-targets注：节点大小以及透明度依据degree值区分。

表1 麻黄-桂枝药对中的活性成分Table 1 Active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair

2.2 RA相关靶点的检索

在GeneCards数据库中,以“rheumatoid arthritis”为关键词,检索得到与RA相关的靶蛋白共4 466个。根据GeneCards数据库中的 “Relevance score”值可判断靶蛋白与RA的相关性,为精减靶蛋白的数量,方便后续处理并提高靶蛋白与RA的相关性,选择“Relevance score”不小于中位数的靶蛋白用于后续处理。计算得到“Relevance score”的中位数为1.44,最终筛选到“Relevance score”不小于1.44的靶蛋白共2 046个。将麻黄-桂枝药对中的活性成分对应的候选靶点与RA相关靶蛋白进行相互映射取交集,如韦恩图(图2)所示,共有134个交集靶蛋白。取这些交集靶蛋白对应的化合物绘制交集靶点-化合物网络图(图3),共得到161个节点和373条边,平均degree值为5;然后利用Cytoscape 3.8软件对网络图拓扑数据进行分析。网络图中degree值高于平均degree值的节点共有26个,其中含有13个活性成分：MH6(槲皮素,degree=102)、MH7(木犀草素,degree=47)、A1(β-谷甾醇,degree=43)、MH4(山奈酚,degree=43)、MH13(柚皮苷,degree=24)、A3(二氢槲皮素,degree=16)、A2(儿茶素,degree=14)、MH8(豆甾醇,degree=13)、MH2(除草素,degree=8)、MH16(芫花素,degree=8)、MH5(花翠素,degree=7)、MH17(柳穿鱼黄素,degree=6)和MH12(香叶木素,degree=6)。

图2 麻黄-桂枝药对中的活性成分对应的候选靶点与RA相关靶点映射交集Figure 2 The intersection mapping of candidate targets corresponding to active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair and RA related targets

图3 麻黄-桂枝药对中的活性成分-交集靶点网络Figure 3 The network of active ingredients in Ephedra-Guizhi drug pair-intersection targets注：图中左侧为活性成分,右侧为交集靶点。

2.3 靶点蛋白相互作用(PPI)网络图

在STRING平台中导入134个交集靶蛋白,进行蛋白-蛋白互作模式(PPI)分析。将数据导入Cytoscape 3.8软件中进行视图分析。由结果(图4)可知：PPI网络图共有109个节点、600条边。靶蛋白的degree值分布在[1,48]范围内,其中degree>25的靶蛋白共8个：TP53(degree=48)、JUN(degree=45)、AKT1(degree=42)、IL6(degree=33)、FOS(degree=33)、RELA(degree=32)、EGFR(degree=27)和CCND1(degree=26),这些关键靶蛋白可能在使用麻黄-桂枝药对治疗类风湿性关节中发挥着重要的作用。

图4 交集靶点蛋白相互作用网络图Figure 4 PPI network of intersection targets

2.4 GO生物信息学分析和KEGG信号通路富集分析

将134个交集靶点导入David数据库进行功能注释分析(GO分析),包括生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)3个方面。GO分析共获得821个条目,依据P值(P<0.01)以及靶蛋白富集数(Count)选取排名前10的条目进行可视化处理。可视化结果(图5A)显示：交集靶蛋白在生物过程中主要涉及对药反应、细胞凋亡过程的负性调节、脂多糖的反应和炎症应答等过程,在细胞组成方面主要参与细胞外间隙、细胞溶质、胞外区域、细胞表面等过程,在分子功能方面主要涉及酶的结合、相同蛋白结合、蛋白质同聚活性、细胞因子活性和蛋白结合等过程。

图5 GO和KEGG分析Figure 5 The GO and KEGG analysis

对交集靶点进行KEGG富集分析,在David数据库中共检索得到127个信号通路,选取P<0.01且富集数排名前20的信号通路。通路富集图分析结果(图5B)表明：交集靶点主要参与肿瘤相关通路(Pathways in cancer)、慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、乙型肝炎(Hepatitis B)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。排名前20的信号通路的富集数、P值、关键靶点如表2所示。

表2 排名前20的信号通路Table 2 The information of top 20 pathways

2.5 麻黄-桂枝“活性成分-靶点-信号通路”网络图构建

依据KEGG分析结果,统计关键靶点-信号通路、化合物-靶点信息。将统计的数据导入Cytoscape 3.8软件中,建立“活性成分-靶点-信号通路”网络图(图6)。该网络图包含34个节点、119条边。网络图显示：MH6(槲皮素)、MH7(木犀草素)、MH4(山奈酚)、MH13(柚皮苷)、A3(二氢槲皮素)和A1(β-谷甾醇)作为活性成分作用于这些关键靶点,调节相关信号通路。按照degree≥15的标准选取核心靶点,分别为AKT1(degree=22)、TP53(degree=20)、RELA(degree=20)、IL6(degree=18)和CCND1(degree=15),提示麻黄-桂枝药对中的活性成分可能通过靶向于上述5个核心靶点来调节相关信号通路,以达到治疗RA的目的。

图6 活性成分-靶点-信号通路图Figure 6 The network of active ingredients-targets-pathways

2.6 分子对接验证

将6个关键活性成分(槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮苷、二氢槲皮素和β-谷甾醇)与5个核心靶点(AKT1、TP53、RELA、IL6和CCND1)进行分子对接研究,验证这些活性成分是否有直接作用于核心靶点的可能。从PDB数据库中获取核心靶点的晶体结构：TP53(PDB ID：6GGC)、AKT1(PDB ID：4EKL)、IL6(PDB ID：4CNI)、RELA(PDB ID：6NV2)和CCND1(PDB ID：6P8G)。在对接实验之前,对共晶化合物进行了重对接,比较对接生成的配体构象与原配体晶体构象的RMSD值。结果显示所有RMSD数值均小于0.2 nm(TP53：0.032 nm、AKT1：0.056 nm、RELA：0.137 nm),证明Glide对接程序可确保对接实验的准确性。关键活性成分与核心靶点的对接分数(表3)显示：活性成分中槲皮素(MH6)、木犀草素(MH7)、二氢槲皮素(A3)与5个核心靶点中的AKT1、TP35、IL6的对接分数较高。

表3 关键活性成分与5个核心靶点的对接分数Table 3 Docking information of key active ingredients and five core targets

为了探究槲皮素、木犀草素以及二氢槲皮素是否可作为AKT1、TP53及IL6靶点的潜在抑制剂,结合蛋白-配体对照组AKT1-GDC0068、TP53-PK9320、IL6-olokizumab对3组蛋白-配体形成的复合物体系进行互作模式分析。

多数AKT1抑制剂通常不直接与磷酸酶磷酸化的2个位点(Thr308和Ser473)结合,而是作用于AKT1蛋白C末端与N末端之间的结合口袋,从而稳定蛋白构象、保护磷酸化位点[12]。对AKT1竞争性抑制剂GDC0068(对接分数为-9.210 kcal/mol)的研究(图7A(a))发现,其与铰链区上氨基酸Glu278、Glu234、Glu228和Ala230存在氢键作用,这类相互作用模式为多数抑制剂的共同作用方式。槲皮素、木犀草素和二氢槲皮素与AKT1抑制剂的作用方式类似,羟基上的氢与铰链区氨基酸Glu228、Ala230及Asp292存在氢键作用(图7A(b)～(d))。

图7 化合物-核心靶点3D作用方式Figure 7 The diagram of compound-core target 3D mode of action

在RA患者的滑膜细胞内,TP53基因在氧化应激的状态下发生了点突变。突变后,TP53蛋白量与类风湿关节炎患者关节的受侵袭程度、破坏程度呈正相关。PK9320(对接分数为-9.354 kcal/mol)作为一种TP53突变体(DNA结合位点突变)的稳定剂,可结合于突变体的蛋白口袋,进而稳定蛋白构象,这种结合带来的稳定效果使TP53恢复了原有功能[13]。如图7B所示,PK9320氨基上的氢以及呋喃上的氧分别与Asp228、Cys220形成氢键作用。槲皮素与木犀草素的作用方式相似,苯环上的羟基均与Cys220、Leu145形成氢键作用,二氢槲皮素在口袋中还与Thr150、Asp228存在氢键作用。

IL6反信号传导在介导自身免疫病理中起到关键作用,调节IL6/gp130信号通路是治疗一系列疾病的有效治疗方法。奥洛昔单抗(olokizumab)通过与IL6结合来阻止IL6与gp130的结合,从而达到抑制IL6/gp130信号通路的目的,其中Trp157为IL6结合域的关键氨基酸[14]。木犀草素与槲皮素黄酮结构中的A环和与之相连的杂环与Trp157之间存在π-π共轭作用,并与Ser47、Glu51、Lys54形成氢键作用(图7C)。

槲皮素(MH6)、木犀草素(MH7)、二氢槲皮素与AKT1、TP53、IL6的对接分数接近于阳性对照组的对接分数,其中木犀草素的对接分数更接近于阳性对照组的。作用方式分析显示上述3个化合物均可于关键位点形成相互作用,这与成药作用模式类似,表明这3个化合物具有直接作用于3类核心靶点的潜力。

3 讨论

RA是一种自身免疫性疾病,骨降解、软骨和骨滑膜破坏是RA病理机制的3个主要途径。树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞与自身抗原结合引起关节发炎,这些细胞可通过相关信号通路来增加白细胞介素1、6、17(IL1、IL6、IL17)等炎性因子,进一步激活骨滑膜上的免疫细胞,加重关节炎症情况[15]。RA可对除骨关节外的其他器官造成损害,其治病机理涉及诸多蛋白之间的相互作用十分复杂,从单靶点、单通路探究RA治疗机制难以取得成效。所以,结合蛋白-蛋白相互作用从多机制、多成分上探究,对治疗RA十分关键。

本研究借助网络药理学来研究麻黄-桂枝药对中的活性成分治疗RA的潜在机制。结果显示：槲皮素、木犀草素和二氢槲皮素作为主要活性成分,与核心靶点存在潜在的相互作用方式。槲皮素具有抑制炎症介质的表达和分泌、抗氧化、免疫调节的功能,可抑制关节滑膜组织细胞增生,从而缓解RA症状。SALEEM等[16]的研究表明：槲皮素可减少关节炎动物模型体内炎症的发生以及关节滑膜增生,同时可使IL6、TNF-α和NF-κB等关键炎性因子下调。木犀草素是一种类黄酮化合物,具有抗炎、免疫调节和抗氧化等活性。沈瑞明等[17]建立了急性痛风性关节炎模型,对木犀草素抗关节炎作用进行研究,发现木犀草素各剂量组造模后,各时间点的关节肿胀指数均降低。另外,木犀草素能显著降低IL1β、IL6、TNF-α的表达水平[18]。木犀草素还可通过影响核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)的信号通路来降低巨噬细胞表达炎性因子的水平,从而减少一氧化氮和促炎性类花生酸的产生[19]。ZHANG等[20]的研究表明二氢槲皮素可抑制NF-κB配体受体激活剂(RANKL)诱导的人骨髓巨噬细胞(BMM)的破骨细胞形成。在脂多糖刺激的RAW264.7细胞中,二氢槲皮素呈剂量依赖性地降低TNF-α、IL1和IL6的表达水平[21]。

分子对接实验结果显示关键活性成分槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素可与AKT1、TP53、IL6形成较强的相互作用,且蛋白-配体间的作用模式与阳性对照药的相同。AKT1是 PI3K-Akt 信号通路的重要调节因子,研究表明血清TNF的升高水平是由AKT1/NF-κB信号通路介导的[22]。在被破坏性表型的滑膜成纤维细胞中,HDAC、JUN、NFKB1、TNF和TP53是调控滑膜细胞成纤维细胞侵袭性的关键调控因子[23]。IL6作为RA致病机理中的重要炎性因子,在许多病变关节滑膜细胞以及其他器官中高表达,针对IL6设计合成抑制剂一直以来是治疗RA的关键途径。

在生物功能分析中,关键靶点主要涉及对脂多糖的反应、炎症应答等过程。脂多糖在体内可刺激免疫细胞分泌炎性介质,使RA-FLS和MM-9的表达量增加,增加对关节组织的损害。KEGG分析中,交集靶点多数富集于肿瘤相关通路上,其中在TNF信号通路、PI3K-Akt 信号通路和Toll样受体信号通路中关键靶点均有富集。TNF信号通路在RA介导的炎症反应中起着重要的作用,可促进TNF-α表达。TNF-α是治疗RA的关键靶点,针对该靶点上市的药物,如英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗等,是治疗RA的一线药物。PI3K-Akt 信号通路和Toll样受体信号通路调控多种细胞过程,包括细胞增殖、细胞存活、自噬、凋亡、分化和血管生成,均涉及关节中巨噬细胞、树突状细胞和滑膜成纤维细胞的增殖表达[24]。IL17可增强成纤维样滑膜细胞中IL6和IL8的产生,而这一过程是通过激活PI3K-Akt 信号通路来实现的[25]。

4 结论

本研究首先通过TCMSP数据库检索麻黄、桂枝中的活性成分以及对应的靶点蛋白,在GeneCards数据库中以“rheumatoid arthritis”为关键词检索RA相关靶点,将收集的2类靶点相互映射取交集后通过STRING平台构建PPI网络,并利用Cytoscape软件进行可视化分析;然后借助David 6.8 数据库,对交集靶点进行GO与KEGG富集分析;最后,利用Schrodinger软件对核心靶点与关键活性成分进行分子对接验证。PPI分析得到核心靶点为AKT1、IL6、TP53、RELA和CCND1。GO与KEGG富集分析得到关键信号通路为TNF信号通路、Toll样受体信号通路和PI3K-Akt信号通路。分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、二氢槲皮素与AKT1、IL6、TP53有较好的结合效果。由此推测麻黄-桂枝药对可能是通过槲皮素、木犀草素和二氢槲皮素等关键活性物质作用于AKT1、TP53和IL6等靶点,从而抑制TNF信号通路,减少TNF-α关键炎性介质表达;同时对PI3K-Akt 信号通路和Toll样受体信号通路进行调节,以抑制关节滑膜中树突细胞以及巨噬细胞过量增殖,减少细胞中IL6、IL17等炎性因子表达,从而阻止RA病理发展进程。

本研究利用网络药理学整合药物-靶点相关信息,为从多靶点多通路探讨中药治疗RA作用机制提供了参考;利用分子对接实验进一步探究多组分与多靶点之间潜在的关系,从分子机制水平上探究了麻黄-桂枝药对治疗RA可能的作用机制,为从中药中探究活性成分、核心靶点和潜在机制提供了方法。