戴文涛,武 瑞,张亚南,侯欣宇,彭代银,3

(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012;2.中药复方安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;3.安徽道地中药材品质提升协同创新中心,安徽 合肥 230012)

桃红四物汤(Taohong Siwu Decoction,THSWD)出自清代吴谦等所著的《医宗金鉴》,全方由桃仁、红花、熟地黄、当归、白芍、川芎6味药组成。桃仁、红花是辛润通络药,熟地黄为补血要药,当归补血活血,川芎活血行气,白芍养血益阴。四物汤四味药配伍桃仁、红花使用,共奏活血化瘀、祛瘀生新的功效。临床和实验研究表明,THSWD对脑缺血疾病损伤有显著的治疗作用。课题组前期研究[1-5]发现,THSWD具有增强脑缺血再灌注大鼠的抗氧化能力,抑制神经细胞凋亡,促进脑内缺血区的血管新生,改善脑损伤等多种效应。THSWD的成分复杂,药物靶点众多,体内过程尚缺乏研究。体内过程是药物发挥疗效的基础,脑卒中的病位虽在于脑,但其病机是多个脏腑相互影响的结果,因此对组织分布的研究有助于阐明其物质作用基础与方剂组方原理[6-7]。课题组前期分析了THSWD入血和入脑的原型成分和代谢产物,发现黄酮类、芳香有机酸类和挥发油类等化合物可能是THSWD治疗脑卒中的主要物质基础[8],藁本内酯、苦杏仁苷、芍药苷、羟基红花黄色素A、阿魏酸等主要活性成分均可在血中被检出[9]。

本实验基于大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,建立UPLC-MS分析方法,检测THSWD中5种主要活性成分在MCAO模型大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织的分布特征,为进一步明确THSWD的作用机制和药效物质基础提供依据。

1 材料

1.1 药材 桃仁为蔷薇科植物桃(Prunuspersica(L.)Batsch)或山桃(Prunusdavidiana(Carr.)Franch.)的干燥成熟的种子(批号 100152),红花为菊科植物红花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花(批号 170025),川芎为伞形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根茎(批号 17010335),熟地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的干燥块根(批号 250092),当归为伞形科植物当归[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]的干燥根(批号 161108),白芍为毛茛科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的干燥根(批号 1711014),以上药材均购自安徽省亳州市沪谯药业有限公司,并经安徽中医药大学中药资源教研室鉴定,符合2020年版《中华人民共和国药典》一部相关规定。

1.2 仪器 ExionLC AD超高效液相色谱仪:日本Shimadzu;ABSciex QTRAP 5500三重四极杆-线性离子肼串联质谱仪:美国SCIEX;AB135-S型十万分之一电子分析天平:德国METTLER TOLEDO公司;CP2250分析天平:上海越平科学仪器有限公司;TG16-WS台式高速离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司;Cascada Ⅲ超纯水仪:美国PALL公司;T18 ΜLTRA-TURRAX组织匀浆机:德国IKA公司;MTN-2800D型氮吹仪:天津金贝尔科技有限公司。

1.3 试剂 芍药苷、苦杏仁苷、藁本内酯、阿魏酸、羟基红花黄色素A均购于成都德思特生物技术有限公司,批号分别为DSTDS007001、DST200710-004、DSTDH000702、DST210901-081、DSTDQ001703;其他试剂均为分析纯。

1.4 动物 60只SPF级健康雄性SD大鼠,体质量(220±20)g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司[生产许可证号:SCXK(鲁)2019-0006]。饲养室温度为(25±2)℃,相对湿度为40%～65%,通风良好,所有大鼠均给予标准饲料进行喂养,自由饮水。

2 方法

2.1 THSWD乙醇提取物的制备 各药材按《方剂学》教材中复方配伍比例,即m(熟地黄)∶m(当归)∶m(白芍)∶m(川芎)∶m(桃仁)∶m(红花)=4∶3∶3∶2∶3∶2,加入75%乙醇回流提取2 h(乙醇加入量为所加药物质量总和的10倍量),过滤,收集滤液,滤渣加入75%乙醇回流提取2 h(乙醇加入量为所加药物质量总和的8倍量),过滤,将2次滤液合并,旋转蒸发,浓缩制成生药含量50 g/kg的浓缩液,4 ℃保存备用。

2.2 脑缺血再灌注大鼠模型的建立 取60只雄性SD大鼠适应性饲养7 d后准备实验,大鼠于模型建立前一晚禁食,参照线栓法[10]构建MCAO模型,再灌注24 h后,参照Zea Longa评分法[10],对大鼠进行神经功能学评分,验证模型是否成功。

2.3 动物分组、给药与组织样品采集 取脑缺血再灌注大鼠模型建立3 d后的大鼠36只,分为6组,每组6只,单次给药THSWD(36 g/kg),给药容积按10 mL/kg,给药前12 h禁食不禁水,于给药后0.5、1、2、4、8、12 h 6个时间点进行腹主动脉取血,然后分批取出组织(心、肝、脾、肺、肾、脑),将组织放入生理盐水中洗去血液,再置于干净滤纸上吸干水分,放入塑封袋中,于-80 ℃冰箱冷冻保存。

2.4 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC CSHTM C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm),流速0.2 mL/min,柱温25 ℃,进样量为2 μL,进样时间24 min,流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱:0～5 min,90%～83% A;5～15 min,83%～75% A;15～18 min,75%～58% A;18～20 min,58%～30% A;20～24 min,30%～10% A。

2.5 质谱条件 采用电喷雾电离源(electrospray ionization,ESI),正、负离子模式同时扫描;喷雾电压5 500 V;离子化温度550 ℃;Gas为241.3 kPa,Gas 1为379.2 kPa,Gas 2 为379.2 kPa。另外对碰撞电压(collision energy,CE)、去簇电压(declustering potential,DP)以及检测离子对优化处理,优化后的条件参数见表1。

表1 5种成分及内标的质谱条件

2.6 对照品溶液、内标溶液的制备 精密称量5种标准品:羟基红花黄色素A 2.33 mg、苦杏仁苷2.64 mg、芍药苷2.3 mg、阿魏酸2.45 mg、藁本内酯2.20 mg,分别用甲醇溶解在5 mL容量瓶中并定容,用甲醇梯度稀释至所需浓度。准确称取原儿茶酸1.52 mg,用甲醇溶解在5 mL容量瓶中并定容,取内标储备液适量,再用甲醇稀释,得最终质量浓度为5 μg/mL的内标溶液。

2.7 样品的处理 取大鼠组织样本200 mg,加入生理盐水600 μL制成匀浆液,置于5 mL EP管中。加入800 μL的甲醇和50 μL内标进行萃取,振荡5 min后,3 000 r/min离心5 min,吸取上层萃取液置于2 mL EP管中,置于通风橱中氮气吹干。用200 μL甲醇溶解残留物,混匀后以15 000 r/min离心10 min,0.22 μm膜过滤器过滤准备进样。

2.8 质控样品的制备 取空白组织按“2.6”项下操作,制备含羟基红花黄色素A、苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、藁本内酯的低浓度(0.2、0.05、0.5、0.1、0.05 μg/g)、中浓度(5、5、10、5、5 μg/g)、高浓度(10.0、10.0、40.0、10.0、10.0 μg/g)质量控制(quality control,QC)样品用于组织分布研究。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性 取空白肝组织样品,加有混标溶液的空白肝组织样品,以及灌胃THSWD后的肝组织样品,按照“2.6”项下生物样品处理方法处理后,按“2.4”项下色谱条件进样。结果表明该方法专属性良好,空白组织中的内源性成分不干扰待测成分的检测。见图1。

注:A.空白组织;B.空白组织加对照品;C.实测样品;1.苦杏仁苷;2.芍药苷;3.羟基红花黄色素A;4.阿魏酸;5.藁本内酯;6.原儿茶酸图1 5种成分和内标的专属性色谱图

3.1.2 标准曲线和线性范围 取空白组织样品,按照“2.6”项下方法处理,加入8个不同浓度的混标溶液,最后每个浓度样品平行进样6次。以各分析物的溶液浓度为横坐标(x),分析物与内标峰面积的比值为纵坐标(y),进行线性回归,制作标准曲线。结果表明,5种成分在各自线性范围内线性关系良好,满足体内药物分析方法的要求。见表2。

表2 组织中5种成分的回归方程、相关系数、定量下限和线性范围

3.1.3 准确度和精密度 取空白组织样品按“2.6”项下方法处理,制备高、中、低3个不同浓度的QC样品各6份,在同日内连续进样6次计算日内精密度,连续测定3 d计算日间精密度。见表3。结果表明,5种成分在各组织中的准确度和精密度均小于15%,符合生物样品测试要求。

表3 组织中5种成分的精密度、准确度、提取回收率和基质效应

3.1.4 提取回收率和基质效应 取空白组织样品,加入高、中、低3个浓度的混标溶液,按“2.6”项下方法处理,进样分析得到各分析物的色谱峰面积A;另取空白组织样品按“2.6”项下方法处理后,加入与上述浓度相同的混标溶液,同法操作得到各分析物的色谱峰面积B;再取与上述浓度相同的混标溶液直接进样分析,得到各分析物的色谱峰面积C。以“A/B×100%”计算回收率,以“B/C×100%”计算基质效应。见表3。结果显示,5种成分在各组织中的提取回收率为83.68%～104.67%,RSD均小于15%,基质效应为82.40%～103.59%,RSD均小于15%,符合生物样品测试要求。

3.1.5 稳定性 取大鼠空白组织按“2.6”项下方法处理,配置高、中、低3个浓度的6个重复QC样品,考察在室温放置12 h、-20 ℃冰箱放置1个月、冻融3次条件下的稳定性。结果表明,各样品在3种条件下RSD值均小于15%,符合生物样品测定要求。见表4。

表4 组织中5种成分的稳定性(n=6)

3.2 组织分布结果 大鼠灌胃THSWD后,被测成分在MCAO模型组大鼠体内不同时间点各组织中的浓度见图2。结果显示,各成分在组织中0.5 h或1 h左右快速达到最高浓度。藁本内酯在各组织中均有分布,存在时间长,肝、肾组织中浓度较高,脑中也有较高分布。阿魏酸在肾组织中浓度最高,肝组织次之,脾、肺、心组织中浓度较低,存在时间短,脑组织中未见分布。苦杏仁苷在肺组织具有较高分布比例,肾组织中浓度最高,心、肝、脾组织浓度较低,脑组织中可见分布。芍药苷在肝、脾、肺组织浓度较高,肾组织中浓度最高,心、脑组织中浓度较低,脑组织中可见分布。羟基红花黄色素A在肝、脾、肺组织浓度较高,肾组织中浓度最高,心组织1 h后未见分布,脑组织中可见分布。

图2 5种主要成分的组织分布特征

4 讨论

本研究结果表明,经灌胃给药后各成分可快速吸收并分布至组织内,在给药12 h后多数组织中的成分基本代谢完全。

藁本内酯是川芎和当归主要的挥发油成分,分子量小,穿透力强,能通过血脑屏障,在体内分布广泛,肝脏是其主要的代谢器官,脑组织中有较高分布,具有抗氧化、抗炎、降低血脑屏障通透性等多种药理活性,是THSWD治疗缺血性脑卒中的重要物质基础。研究[11]表明,藁本内酯通过下调大鼠水通道蛋白4以及紧密连接蛋白Claudin-5和Zo-1的表达水平,降低血脑屏障通透性,发挥治疗脑缺血的功效。藁本内酯还可以通过激活PI3K/Akt信号通路、抑制Akt/Fox01通路减少氧化应激反应,减少脑梗死体积,发挥神经保护作用[12]。研究表明藁本内酯可能透过血脑屏障,发挥对脑缺血的治疗作用。

阿魏酸是川芎和当归活血祛瘀生新的主要活性成分,具有很强的抗氧化活性和抗血栓作用,可用于治疗心脑血管疾病,保护神经细胞损伤等[13]。肾脏是其主要的代谢器官,在除肝、肾的组织中分布较少,存在时间短,且难以透过血脑屏障,说明阿魏酸在体内吸收、分布、消除快,起效迅速。

羟基红花黄色素A和苦杏仁苷是桃仁、红花发挥活血化瘀功效的主要活性成分,在各组织中均有分布,其中肝、肾、肺组织中浓度较高,说明其对血流丰富的组织具有亲和性。其发挥药理作用的机制涉及抗氧化、抗血栓、保护心脑血管等[14]。其中苦杏仁苷在肺部浓度较高,可能与桃仁镇咳平喘的药理作用有关[15]。

白芍养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛,其主要活性成分芍药苷在体内分布广泛,在各组织中浓度均较高,其中肝、脾、肺组织中浓度最高,可能与白芍养血益阴柔肝的功效有关,有药理研究[16]表明,芍药苷可以调节血虚肝郁模型大鼠的信号传导,通过抗炎,防止血小板凝聚、自由基损伤等途径发挥柔肝解郁的作用。中医学认为,脑卒中是由于肝风内动、肝阴虚所致,脑卒中的发生与肝密切相关,然而这种效应机制是否与脑缺血的治疗有关仍需要进一步研究。

本研究首次建立了UPLC-MS同时测定THSWD中5种主要成分在大鼠组织中的含量分析方法,并研究了口服THSWD后,5种主要成分在脑缺血再灌注模型大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织中的分布情况,5种成分在体内吸收迅速,在不同时间点的器官的分布趋势存在较大差异。