林 琳,刘涛峰

(1.安徽中医药大学研究生院,安徽 合肥 230012;2.安徽中医药大学第一附属医院皮肤科,安徽 合肥 230031)

鹅掌风,好发于手掌,因风毒或湿邪侵于皮肤所致,反复发作后皮肤增厚,枯槁干裂,宛如鹅掌[1],西医称为“手癣”;若发于足部则称为“足癣”,中医称为“脚湿气”。该病主要是由红色毛癣菌、须癣毛癣菌等癣菌引起,但近年来白色念珠菌及其他酵母样真菌的感染率逐渐上升[2]。该病常伴瘙痒,搔抓后加剧,西医常用唑类药物治疗,效果显著,但容易复发,严重影响患者身心健康和正常生活。

鹅掌疯醋剂,又名鹅掌风醋浸剂,是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂(注册号:Z20050075),临床应用已近30年,是皮肤科常用于治疗手足癣的外用抗真菌药。研究[3]表明,鹅掌疯醋剂对多种细菌及真菌具有良好的抑制作用,但其机制不详。本研究选用白色念珠菌为实验对象,探讨鹅掌疯醋剂在体外对白色念珠菌及早期生物膜的抑制作用及其机制,为鹅掌疯醋剂在临床上治疗真菌性疾病提供实验依据。

1 材料

1.1 菌株 白色念珠菌SC5314由安徽中医药大学中西医结合学院汪长中教授惠赠。

1.2 药物与试剂 鹅掌疯醋剂由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供。酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)培养基和沙氏葡萄糖液体(Sabourauddextrose broth, SDB)培养基均由杭州百思生物技术有限公司生产。琼脂粉:北京鸿润宝顺科技有限公司;磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS):太原市罗塞塔石生物技术有限公司;戊二醛:上海远慕生物科技有限公司;锇酸:上海哈灵生物科技有限公司;醋酸双氧铀:西安鼎天化工有限公司;柠檬酸铅:德国默克化工技术有限公司;营养肉汤:中山市百微生物技术有限公司;甘露醇:天津市登峰化学试剂厂;KH2PO4:国药集团化学试剂有限公司;细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8):福州飞净生物科技有限公司。

沙氏琼脂(sabourauds, SDA)培养基:取配好的SDB培养基1 000 mL,加入琼脂粉20 g,高压灭菌后倒板备用。

Spider固体培养基:称取营养肉汤10 g、甘露醇10 g、2 g的KH2PO4、琼脂粉20 g,溶解于少量的蒸馏水中,并调节pH值为7后定容至1 000 mL,高压灭菌后置于4 ℃保存备用。

1.3 仪器 高速离心机(型号JW-3021HR):安徽嘉文仪器装备有限公司;紫外分光光度计(型号photoLab 7600):德国WTW;光学显微镜(型号IX-71):日本奥林巴斯有限公司;多功能酶标仪:美国赛默飞世尔科技公司;扫描电子显微镜(型号GeminiSEM 500):德国蔡司公司;透射电子显微镜(型号JEM-2100F):日本电子株式会社。

2 方法

2.1 白色念珠菌菌悬液的配制 挑取白色念珠菌于SDA培养基中活化后,取较大菌落接种到SDB培养基中,置于37 ℃恒温培养箱中,120 r/min震荡培养24 h。用血细胞计数板计数确定菌悬液浓度范围,并调整孢子菌悬液的浓度至(1～5)×106CFU/mL。

2.2 微量稀释法测量鹅掌疯醋剂对白色念珠菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC) 参照美国临床和实验室标准协会标准[4],采用微量稀释法测量鹅掌疯醋剂对白色念珠菌的MIC,对应稀释倍数分别为原液浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024。

2.3 细胞外紫外物质吸收的变化 实验组取制备好的白色念珠菌菌悬液3 mL与鹅掌疯醋剂(MIC)3 mL混合,对照组取白色念珠菌菌悬液3 mL不作处理,培养10 min后离心,取上清液,立即用紫外分光光度计测定波长为260 nm下的吸光度值[5]。

2.4 扫描电子显微镜观察白色念珠菌表面结构 实验组取制备好的白色念珠菌菌悬液3 mL与鹅掌疯醋剂(MIC)3 mL混合,对照组取白色念珠菌菌悬液3 mL不作处理,培养10 min后离心,洗涤3次,弃上清液,用2.5%戊二醛固定过夜后洗涤3次,乙醇梯度脱水,镀金后通过扫描电子显微镜观察拍照[6]。

2.5 透射电子显微镜观察白色念珠菌超微结构 实验组取制备好的白色念珠菌菌悬液3 mL与鹅掌疯醋剂(MIC)3 mL混合,对照组白色念珠菌菌悬液3 mL不作处理,培养10 min后离心洗涤3次,弃上清液,用2.5%戊二醛固定过夜后洗涤3次,并用1%锇酸固定2 h后洗涤3次,乙醇梯度脱水,环氧树脂包埋切片,以铀铅双染色在透射电子显微镜下观察拍照[7]。

2.6 CCK-8试验测定白色念珠菌生物被膜形成早期黏附性 取100 μL制备好的菌悬液接种于96孔板中,37 ℃培养,分别培养1、2、3、4 h后吸弃培养基及未黏附菌,PBS洗涤3次,实验组加入鹅掌疯醋剂(MIC)100 μL,对照组白色念珠菌菌悬液不作处理,37 ℃培养24 h,在各孔中加入CCK-8溶液,避光培养箱37 ℃孵育2 h,450 nm处检测吸光度值,每组设8个复孔[8-9]。

2.7 芽管形成试验观察白色念珠菌芽管形成的情况 实验组取制备好的白色念珠菌菌悬液3 mL与鹅掌疯醋剂(MIC)3 mL混合,对照组取白色念珠菌菌悬液3 mL不作处理,培养10 min后,各取100 μL涂布于Spider固体培养基,37 ℃培养24 h,光学显微镜观察菌丝生成情况并拍照[10]。

3 结果

3.1 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌的MIC 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌的MIC为药物原浓度的1/16,提示其具有一定的抗真菌能力。

3.2 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌细胞外紫外物质吸收的影响 对照组测得白色念珠菌细胞外的紫外吸收物质含量为(3.727±0.002),实验组测得白色念珠菌细胞外的紫外吸收物质含量为(5.155±0.011),与对照组比较,实验组白色念珠菌细胞外的紫外吸收物质显著升高(P<0.05)。

3.3 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌表面结构的影响 利用扫描电子显微镜观察白色念珠菌的表面结构,结果发现,对照组白色念珠菌细胞呈现圆形或椭圆形,菌体饱满,细胞表面光滑。经过鹅掌疯醋剂处理的白色念珠菌部分菌体细胞表面粗糙、皱缩、萎陷、细胞质内容物渗漏,很难发现形态正常的菌体细胞。见图1。

注:A.对照组;B.实验组图1 扫描电子显微镜观察鹅掌疯醋剂对白色念珠菌表面结构的影响(×10 000倍)

3.4 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌超微结构的影响 对照组白色念珠菌有正常完整的细胞结构,呈圆形或椭圆形,细胞壁、细胞膜光滑,层次完整清晰,细胞内其他部分密度均匀。经过鹅掌疯醋剂处理的菌体损伤比较重,视野中异常的真菌居多,受到损伤细胞的细胞壁受损,呈现扭曲和不规则的形状,细胞膜被破坏,细胞核破裂,细胞器溶解,细胞质成碎渣样。见图2。

注:A.对照组;B.实验组图2 透射电子显微镜观察鹅掌疯醋剂对白色念珠菌超微结构的影响(×20 000倍)

3.5 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌生物被膜形成早期黏附性的影响 对照组相当于CCK-8试验中的空白组,默认其早期黏附性为0。与对照组比较,实验组白色念珠菌早期(1、2、3、4 h)生物膜的黏附率均明显受到抑制(P<0.05),且与其他3个时间点比较,鹅掌疯醋剂对培养了1 h的生物膜的抑制作用最弱。见图3。

注:与1 h组比较,*P<0.05图3 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌早期(1、2、3、4 h)生物膜组织表面黏附率的影响

3.6 鹅掌疯醋剂对白色念珠菌芽管形成的影响 光学显微镜观察显示,对照组白色念珠菌为大量的酵母相细胞和菌丝相细胞,菌丝交织,密度高;实验组白色念珠菌大部分是酵母相细胞,仅有少量菌丝期细胞,且菌体密度明显降低。见图4。

注:A.对照组;B.实验组图4 光学显微镜观察鹅掌疯醋剂对白色念珠菌芽管形成的影响(10×10倍)

4 讨论

鹅掌风名称首见于明代沈之问《解围元薮》[11]。中医认为其多因感受风毒,凝结皮肤,气血失养所致,发为风湿毒聚证,用祛风除湿、杀虫止痒治法;或久病化燥伤阴,肌肤失去阴血濡养而干燥、脱屑,甚则皲裂,发为血虚风燥证[12],用养血润燥、祛风止痒治法[13]。该病病位虽在皮肤,却内连脏腑,累及心、脾胃、肾,如《医宗金鉴·外科心法要诀·鹅掌风》所言:“此证生于掌心……余毒未尽,又兼血燥,复受风毒,凝滞而成。”

鹅掌疯醋剂的主要成分为土荆皮、百部、大黄、苦参、黄柏、川椒。该制剂具有清热解毒、杀虫止痒、软坚润燥的功效,一般为外用,主要用于鹅掌风的治疗[14]。使用方法为将患处充分浸泡在药液中至少10 min,10 d为1个疗程。土荆皮有祛风除湿、杀虫止痒之功,其有机酸、乙醇浸膏及苯浸膏对常见的10种致病真菌均有一定的抗菌作用[15]。百部有润肺下气止咳、杀虫灭虱之功,现代药理实验结果表明其能抗病原微生物[16],抗寄生虫等。

念珠菌对抗真菌药物的特异性靶点相对于其他真菌类较少,实验证明目前抗真菌药物的作用于白色念珠菌的靶点来说主要有以下3个方面:抑制细胞膜成分麦角甾醇合成,为三唑类药物和多烯类药物的作用;抑制细胞壁成分β-1,3-葡聚糖合成,为棘白菌素类药物的作用;抑制核酸合成[17]。

正常情况下,只有直径不超过1 nm的小分子可以通过真菌细胞壁的微孔。当菌体结构遭到了药物作用的损坏,细胞通透性改变,细胞内具有紫外吸收特性的大分子物质也由细胞内泄露到细胞外[18]。花椒、土荆皮和黄连等单味中药具有黄酮类、生物碱类、有机酸类、皂苷类和挥发油类化合物等主要活性成分,能够有效抑制白色念珠菌活性[19],原因可能与其能够破坏真菌菌体的膜结构,改变菌体渗透性有关[20-21]。本研究发现,鹅掌疯醋剂能破坏白色念珠菌的细胞壁或细胞膜,影响菌体渗透性,使细胞内容物漏出,导致白色念珠菌的死亡。

电子显微镜观察显示,鹅掌疯醋剂对白色念珠菌的生长有明显的抑制作用,且观察发现菌体的细胞壁、细胞膜破损,细胞质产生凝聚,细胞核破裂,细胞器溶解,且细胞表面还有一层电子密度高的絮状物质,可能是细胞内物质外泄,表明鹅掌疯醋剂可以破坏念珠菌的菌体结构。而这种破坏菌体结构的抗菌方式,与传统的抗真菌药物不同,故不易引起耐药性[22]。研究[23-24]发现,复方中药药方厚朴煎剂和三黄苦参汤对真菌的体外抗菌方式均可能与破坏菌体结构有关。

念珠菌黏附宿主表面的能力是感染期间成功定殖和持久的先决条件[25]。CCK-8是一种高灵敏度、非放射性的比色法,可用于细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等实验,较传统MTT法更有优势[26]。CCK-8法检测发现,鹅掌疯醋剂浸泡白色念珠菌生物被膜细胞后,白色念珠菌表面黏附性明显降低,说明鹅掌疯醋剂可以降低生物被膜的黏附性,从而抑制早期生物膜的形成,降低白色念珠菌对宿主的定殖能力,减少感染宿主的机会。与其他3个时间点比较,鹅掌疯醋剂对培养了1 h的白色念珠菌早期生物膜表面黏附性抑制率较低,可能与白色念珠菌在生长周期的早期生长速度更快有关,后期抑制率逐渐升高并趋于平稳。

白色念珠菌的形态转化是病原体感染宿主机制的核心,酵母相细胞参与附着和传播,而菌丝相使念珠菌更具侵入性,能更有效地渗透和附着在宿主组织上[18],并形成成熟的生物膜以逃避宿主免疫细胞的吞噬,这对宿主感染的致病机制至关重要[27-28]。酵母相细胞黏附在宿主表面,菌丝大量生产,并且分泌细胞外基质,最终形成结构致密的成熟网状生物膜[29]。念珠菌成熟的生物膜的形成会增加其对抗真菌药物的耐药性,造成了念珠菌病患者较高的死亡率,目前针对念珠菌生物膜的药物的敏感性仍然很低[29]。本研究通过光学显微镜观察到鹅掌疯醋剂能够抑制白色念珠菌菌丝形成,降低芽管的形成能力,抑制白色念珠菌的形态转化,并能有效抑制早期生物被膜的生成。

综上所述,鹅掌疯醋剂对白色念珠菌MIC值为药物原浓度的1/16,有一定的抗真菌能力,其作用机制可能是通过改变菌体渗透性,破坏菌体的正常结构,抑制生物被膜早期黏附性和芽管的形成而有效抑制生物被膜的生成,从而发挥抗真菌的作用。