程 凯,陈 前,袁慧伦,程连芝,江爱娟

(安徽中医药大学中西医结合学院,安徽 合肥 230012)

根据国际糖尿病联合会的最新数据[1-2],2021年全球成年人(20～79岁)患有糖尿病者有5.37亿,且约25%糖尿病患者最终伴发糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain,DNP)。DNP是以感觉障碍,自发性疼痛,四肢烧灼样疼痛、刺痛,温痛觉超敏为临床特征,严重影响患者的生活质量[3]。背根神经节是疼痛的反应中枢。在DNP的发展过程中,各种外周刺激可使离子通道表达水平发生改变,导致背根神经节过度兴奋,从而引起疼痛[4]。研究表明,背根神经节中电压门控钠通道1.7(Nav1.7)和Nav1.8参与痛觉的发生和传导。外周神经损伤时,神经的自发性动作电位和异常的高频活动导致Nav1.7和Nav1.8在背根神经节中高度表达,Nav1.7和Nav1.8表达水平升高可以扩大疼痛信号,增强疼痛传导[5]。针药结合是临床上治疗疾病的常用方法,可以提升疗效,减少药物不良反应[6]。前期研究[7-8]表明,益气活血通络方和针刺治疗可以有效缓解DNP大鼠的疼痛症状,减轻大鼠疼痛反应。因此,本研究旨在观察针药结合对DNP大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8表达的影响,为临床治疗DNP提供依据。

1 材料

1.1 动物 58只SPF级SD大鼠,体质量180～210 g,购自江苏省南京青龙山动物繁殖场[生产许可证号:SCXK(浙)2019-0002]。所有大鼠自由饮食,饲养于室温20～25 ℃、湿度25%～30%环境下。实验动物伦理编号为AHUCM-rats-2020031。

1.2 药物与试剂 益气活血通络方(黄芪30 g,鸡血藤15 g,生地黄、当归、葛根各 12 g,延胡索、威灵仙各9 g;安徽中医药大学第一附属医院院内制剂,批号20220418);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;批号EZ3414B220):德国BioFroxx公司;BCA(批号 PICPI23223):德国赛默飞世尔科技公司;Nav1.7(批号 252100):美国ZEN Bio公司;Nav1.8(批号 ab63331):英国Abcam公司。

1.3 仪器 血糖仪(5D-2型):北京怡成生物电子技术有限公司;智能热板仪(RB200):成都泰盟软件有限公司;Electric von Frey电子测痛仪(2392型):美国IITC公司;PowerPacUniversal通用电泳仪:美国伯乐公司;实时荧光定量PCR仪(7500型):美国应用生物系统公司;凝胶成像分析系统(Tanon-5200):上海天能科技有限公司;冰冻切片机(CM1850):德国徕卡公司;荧光显微镜(ECLIPSE Ni):日本尼康公司。

2 方法

2.1 DNP模型复制 参照文献[9-10]的方法,将58只雄性SPF级SD大鼠适应性喂养1周,随机选取9只作为空白组,普通饲料喂养,其余大鼠使用高脂饲料喂养4周,使之产生胰岛素抵抗。4周后单次腹腔注射STZ(35 mg/kg),72 h后,测量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG≥11.1 mmol/L判定为2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)模型大鼠。2周后检测T2D大鼠的机械痛阈(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足反应时间(thermal withdrawal latency,TWL),若MWT下降至基础值85%以下,且TWL减少至基础值85%以下,则判定为DNP模型大鼠。

2.2 动物分组及治疗 将DNP模型大鼠随机分为模型组、针刺组、中药组与针药结合组,每组9只。空白组不作处理;模型组给予生理盐水灌胃;针刺组参照大鼠的解剖定位,对比人体的穴位分布,选取“足三里”穴每日进行针刺治疗,针刺20 min;中药组用益气活血通络方(9 g/kg)灌胃治疗,每日1次;针药结合组采用益气活血通络方和针刺“足三里”穴联合治疗,在灌胃后进行针刺,每日1次,方法同上。

2.3 MWT测定 将各组大鼠放置于筛状金属板上,用有机玻璃罩分隔开,静息30 min。然后用Electric von Frey电子测痛仪垂直刺激大鼠后掌底,当大鼠出现抬足或者躲避时仪器上所显示的数值,即为MWT。连续测4次,每次测量间隔15 s,取其平均值。每周测定1次。

2.4 TWL测定 提前将热板测痛仪预热至52 ℃,将大鼠放入其中。当大鼠足部接触热板开始计时,当大鼠出现舔后足时停止计时,每只大鼠重复测定3次,每次测定间隔时间为5 min,其平均值即为TWL。每周测定1次。

2.5 样本采集和处理 实验结束后,对大鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉。然后固定俯卧位,用外科剪刀和手术刀分出大鼠脊柱,从腰骶膨大处手术切出L4—L6段,然后用眼科剪及镊子取出大鼠背根神经节并保存在-80 ℃冰箱。

2.6 Western blot法检测大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8蛋白表达水平 使用蛋白质提取试剂盒从背根神经节组织中提取总细胞蛋白,并使用BCA试剂盒测量浓度。用10% PAGE电泳分离蛋白质,并转移到PVDF膜上。随后在5%脱脂奶粉中封闭2 h后,将膜与Nav1.7、Nav1.8、β-actin在4 ℃下孵育过夜,然后室温下二抗孵育2 h。使用ECL化学发光液并在凝胶成像系统中进行分析。

2.7 qRT-PCR法检测大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平 使用Trizol提取大鼠背根神经节中总RNA,测定RNA纯度,将RNA逆转录成cDNA,使用SYBR法进行扩增,检测Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平,最后用2-ΔΔCT法计算mRNA相对表达水平。本实验所使用的引物序列:

β-actin正向引物:5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′;β-actin反向引物:5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′;Nav1.7正向引物:5′-CGCTGCTGAGTTCAC-GAGTATAGG-3′;Nav1.7反向引物:5′-CGGTTTCTTCTCTCCTTGGCACTC-3′;Nav1.8正向引物:5′-CTTTCCCGCCATCCTATGACAGTG-3′;Nav1.8反向引物:5′-CTTCCTTAGCAGC-GACCTCATCTTC-3′。

2.8 免疫荧光法检测背根神经节中Nav1.7、Nav1.8表达水平 将L4—L6背根神经节在10%组织固定液中固定,随后将组织通过蔗糖梯度溶液脱水,包埋组织,通过切片机将组织切片。用10%山羊血清封闭30 min,并与一抗(Nav1.7、Nav1.8)在4 ℃下孵育过夜,再将载玻片与二抗(山羊抗兔IgG)室温下孵育1 h,载玻片添加DAPI孵育5 min。载玻片用抗荧光淬灭固定介质固定,并用荧光显微镜观察Nav1.7、Nav1.8的表达情况,使用Image J(1.8.0)计算Nav1.7、Nav1.8的荧光强度。

3 结果

3.1 不同时点5组大鼠MWT、TWL比较 与空白组比较,治疗前模型组大鼠MWT、TWL均显著降低(P<0.05);治疗1周后,与空白组比较,模型组、针刺组、用药组和针药结合组MWT持续降低,TWL持续缩短;治疗2、3、4周后,与模型组比较,中药组、针刺组、针药结合组MWT显著升高,TWL显著延长(P<0.05),且针药结合组MWT、TWL显著高于中药组和针刺组(P<0.05)。见图1。

注:A.空白组;B.模型组;C.针刺组;D.中药组;E.针药结合组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与针刺组比较,△P<0.05;与中药组比较,◇P<0.05图1 5组大鼠MWT、TWL比较

3.2 5组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8蛋白表达水平比较 治疗4周后,与空白组比较,模型组大鼠背根神经节组织中Nav1.7、Nav1.8蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,针刺组、中药组和针药结合组大鼠背根神经节组织中Nav1.7、Nav1.8蛋白表达水平显著降低(P<0.05);针药结合组大鼠背根神经节组织中Nav1.7、Nav1.8蛋白表达水平显著低于中药组和针刺组(P<0.05)。见图2。

注:A.空白组;B.模型组;C.针刺组;D.中药组;E.针药结合组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与针刺组比较,△P<0.05;与中药组比较,◇P<0.05图2 5组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8蛋白表达水平比较

3.3 5组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平比较 与空白组比较,模型组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平均显著上升(P<0.05);与模型组比较,针刺组、中药组和针药结合组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);针药结合组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平显著低于针刺组和中药组(P<0.05)。见图3。

注:A.空白组;B.模型组;C.针刺组;D.中药组;E.针药结合组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与针刺组比较,△P<0.05;与中药组比较,◇P<0.05图3 5组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8 mRNA表达水平比较

3.4 5组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8荧光表达水平比较 与空白组比较,模型组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8的荧光表达水平显著上升(P<0.05);与模型组比较,针刺组、中药组和针药结合组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8荧光表达表达水平显著降低(P<0.05);针药结合组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8荧光表达水平显著低于针刺组和中药组(P<0.05)。见图4。

注:大鼠背根神经节的免疫荧光染色结果(10×50倍,蓝色代表DAPI,绿色代表Nav1.7、Nav1.8);A.空白组;B.模型组;C.针刺组;D.中药组;E.针药结合组;与空白组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与针刺组比较,△P<0.05;与中药组比较,◇P<0.05图4 5组大鼠背根神经节中Nav1.7、Nav1.8荧光表达水平比较

4 讨论

DNP发病机制复杂,西医治疗的效果不理想,而针药结合治疗DNP的效果明显,是治疗DNP的重要方法[11]。DNP可归属于中医学“消渴病”“痹证”范畴,因消渴日久,阴虚内热,瘀血阻滞而成[12]。益气活血通络方是临床治疗DNP的有效验方。临床研究[13-14]表明,该方可以降低血液黏稠度,改善微循环,调节细胞因子、神经内分泌和炎症因子,从而有效缓解糖尿病神经病变患者疼痛症状。课题组前期研究[15]表明,益气活血通络方可以改善DNP大鼠微循环,降低血脂水平,减轻脊髓神经炎症反应,对抗神经细胞凋亡,促进神经细胞再生,进而缓解DNP大鼠疼痛症状。针灸对疼痛具有独特疗效[16]。足三里穴是临床治疗糖尿病周围神经病变的常用穴位,为足阳明经合穴,针刺足三里治疗DNP起到活血通络、除痹止痛的作用。临床研究[17]表明,针刺足三里可以有效缓解糖尿病周围神经病变导致的疼痛,改善神经传导速度。课题组前期研究[7]表明,针刺足三里可以通过改善DNP大鼠炎症反应,缓解疼痛症状。针药结合是常用的中医治疗方法,早在《素问·移精变气论》就有“毒药治其内,针石治其外”的记载,针药结合因其疗效显著,被历代中医大家所尊崇。中药内服可以调整人体的阴阳平衡和改善脏腑气血生理功能,外用针灸可以疏通经络,调整气血运行方式,从而达到通经止痛的目的[18]。针药结合可以通过内外同治达到纠正人体气血阴阳失衡,改善全身状态,进而发挥治疗疾病的作用。本实验根据课题组前期方法构建DNP大鼠模型,与空白组比较,模型组大鼠MWT显著降低,TWL显著缩短。而经过益气活血通络方、针刺、针药结合3种治疗方式干预后,3组大鼠MWT先下降后逐渐回升,TWL先缩短再逐渐延长,说明3种治疗方式都可以缓解DNP大鼠的疼痛症状。而针药结合组与益气活血通络方组和针刺组比较,DNP大鼠MWT显著回升,TWL显著延长,说明针药结合相较于单纯用药和单纯针刺而言,更能缓解DNP大鼠的疼痛症状。

背根神经节参与神经病理性疼痛的治疗机制,而Nav1.7和Nav1.8在背根神经节中高度表达,在背根神经节动作电位的传导过程中占主导作用[19]。研究[20]表明,在神经病理性疼痛中,Nav1.7和Nav1.8的表达水平增高与疼痛的程度呈正相关,而通过抑制Nav1.7和Nav1.8的表达,可以起到很好的镇痛作用。DNP模型大鼠的痛觉过敏,同时伴随背根神经节中Nav1.7和Nav1.8增加,而通过干预手段降低背根神经节中Nav1.7和Nav1.8的表达水平,可以有效缓解DNP大鼠的疼痛[21]。刘鹏等[22-23]的研究证明,中药可以改变背根神经节中Nav1.7和Nav1.8表达,从而缓解糖尿病病理性疼痛。Liao等[24]和Yen等[25]发现,针刺足三里可以改变神经疼痛大鼠背根神经节中Nav1.7和Nav1.8表达,进而改善大鼠疼痛症状。在本实验中,与空白组比较,模型组大鼠背跟神经节中Nav1.7和Nav1.8表达水平显著升高,说明Nav1.7和Nav1.8参与DNP发生发展,这与Chattopadhyay等[21]的实验结果一致。而经过益气活血通络方、针刺、针药结合3种治疗方式干预后,大鼠背根神经节中Nav1.7和Nav1.8的表达水平显著降低;而针药结合组与中药组和针刺组比较,Nav1.7和Nav1.8的表达进一步降低,说明针药结合能进一步降低大鼠背根神经节中Nav1.7和Nav1.8的表达水平。

综上所述,益气活血通络方联合针刺可有效缓解大鼠DNP,且效果优于单纯针刺和益气活血通络方,其作用机制可能与其抑制背根神经节中Nav1.7和Nav1.8的表达有关。DNP的机制复杂,针药结合是否还可以通过其他通路来影响DNP还需要进一步探究。