王淼,付书琴,宋春兰

(1.郑州大学第一附属医院 儿科,河南 郑州 450000;2.郑州大学附属儿童医院 普通内科,河南 郑州 450000)

手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)是我国乃至世界各地常见的儿童急性传染病,传染性强,病死率高[1]。HFMD以肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)型或柯萨奇A组病毒16型感染为主,多发于年龄较小的儿童。近年来新增的HFMD患儿多由EV71型病毒感染,起病急,进展快,出现一系列炎症反应,使机体免疫系统发生改变,部分患儿可出现神经源性肺水肿、脑干脑炎等严重并发症[2],给公共卫生安全带来巨大挑战。HFMD的发病机制复杂,涉及广泛,目前研究广泛认为EV71型、柯萨奇A组病毒16型等通过与感染者的咽喉部及肠道上皮细胞表面的SCARB2和PSGL-1受体相结合,释放炎症介质,进入人体各个系统,导致相应的临床症状[3]。临床上早期识别重症HFMD能够为患儿的及时诊疗并进行预后评估提供重要的参考依据。共刺激信号分子OX40/OX40L属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员,存在于活化的CD4+T和CD8+T细胞表面,且主要是CD4+T细胞,有较强的区域特异性。本研究通过检测儿童外周血CD4+T细胞OX40、CD14+单核细胞上OX40L的表达,探讨其在儿童HFMD中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2019年1月至2022年8月在郑州大学附属儿童医院住院并确诊为HFMD的144例患儿,根据病情轻重程度分为轻症组(95例)、重症组(49例)。(1)纳入标准:①HFMD患儿年龄6个月～5岁;②HFMD符合《手足口病诊疗指南(2018年版)》[4]的诊断标准,病毒感染类型为EV71型;③轻症HFMD的表现为不同程度的发热、口腔黏膜疱疹,手、足、臀部出现疱疹或斑丘疹等,重症HFMD的表现为发病1周内出现脑炎、脑膜炎、脑脊髓膜炎、神经源性肺水肿等,或合并呼吸、心血管、神经等系统受累。(2)排除标准:①伴有先天性疾病、免疫缺陷或其他系统重大疾病;②合并其他类型病毒的感染。另选取50名健康体检儿童为对照组。轻症组男48例,女47例;年龄6个月～5岁,平均(2.81±1.34)岁;病程0.5～5 d,平均(3.24±1.32)d。重症组男28例,女21例;年龄8个月～4岁,平均(2.92±1.01)岁;病程1～5 d,平均(3.51±1.12)d。对照组男27例,女23例;年龄7个月～5岁,平均(2.61±1.40)岁。各组性别、年龄和病程比较差异均无统计学意义(P>0.05)。参照危重病例评分(pediatric critical illness score,PCIS)标准[5]对144例HFMD患儿进行评分,范围为71～94分。本研究经医院医学伦理委员会批准,所有入组患儿及对照组儿童监护人均签署知情同意书。

1.2 标本收集及实验室检测抽取入组HFMD患儿入院确诊后24 h内清晨空腹静脉血2 mL备用,同时抽取50例健康体检儿童清晨空腹静脉血2 mL。所有标本血置于乙二胺四乙酸抗凝管中,充分混匀。取每管全血40 μL,依次加入FITC标记的小鼠抗人CD4、CD14单克隆抗体,以及PE标记的小鼠抗人OX40和OX40L单克隆抗体。另取每管全血40 μL,设立同型对照管,分别加入与各检测管荧光标记抗体相对应的FITC和PE标记的小鼠IgG。室温避光孵育30 min后加入红细胞裂解液200 μL,37 ℃水浴10 min后加入PBS终止红细胞裂解反应,1 600 r·min-1离心5 min,弃上清,加入PBS 500 μL待测,采用流式细胞仪检测OX40和OX40L水平。白细胞(white blood cell,WBC)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)由医院检验科常规检测。FITC标记的抗人CD4单克隆抗体、CD14单克隆抗体及PE标记的小鼠抗人OX40单克隆抗体均购自美国Beckman公司,PE标记的小鼠抗人OX40L抗体购自美国BioLegend公司;FITC和PE标记的小鼠IgG购自美国BD Biosciences公司;流式细胞仪购自美国Beckman公司。

2 结果

2.1 外周血OX40、OX40L、WBC及IL-6的水平3组OX40、OX40L、WBC、IL-6水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。轻症组、重症组的OX40、OX40L、IL-6水平均高于对照组(P<0.05),重症组OX40、OX40L、IL-6水平均高于轻症组(P<0.05),重症组WBC高于对照组(P<0.05),但与轻症组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组儿童外周血OX40、OX40L水平比较

2.2 PCIS评分轻症组PCIS评分为90(86,92)分,重症组为78(75,79)分,差异有统计学意义(Z=9.746,P<0.001)。

2.3 OX40和OX40L水平与PCIS的相关性分析结果显示,HFMD患儿OX40的表达与PCIS有相关性(r=-0.729,P=0.012),OX40L的表达与PCIS无相关性(r=-0.179,P=0.372)。

2.4 外周血OX40、OX40L、WBC和IL-6识别重症HFMD的ROC曲线比较外周血OX40、OX40L、WBC和IL-6诊断重症HFMD的效能,OX40的曲线下面积(area under curve,AUC)最大,为0.844(95% CI:0.780～0.908),其诊断重症HFMD效能较高。OX40L的AUC为0.712(95% CI:0.628～0.795);WBC的AUC为0.603(95% CI:0.507～0.698);IL-6的AUC为0.629(95% CI:0.534～0.723),见图1。当截断值为16.44%时,OX40对重症HFMD的诊断效能最高。

图1 外周血OX40、OX40L、WBC和IL-6的AUC

3 讨论

HFMD是儿童常见的一种急性传染病,主要由EV感染引起,包括EV71、柯萨奇A组病毒16、4、5、6、7、9、10型及埃可病毒等。其中以EV71及柯萨奇A组病毒16型多见。大多数HFMD患儿发病呈自限性,临床症状轻微,少数患儿病情进展迅速,可发展为重症[6-7]。其中EV71具有高度嗜神经性,可累及神经系统导致无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、肺出血甚至死亡等。HFMD严重威胁着学龄前特别是3岁以下儿童的健康,发病率稳居儿童丙类传染病的首位,已成为社会广泛关注的公共卫生安全问题,在疾病早期进行有效的诊断及治疗对改善患儿预后意义重大[8]。有研究表明EV71感染所致的HFMD可能与机体出现免疫失衡与紊乱相关,尤其是细胞免疫[9]。细胞免疫是机体防御的重要屏障,在机体免疫应答中起着非常重要的作用。EV71型病毒感染机体后可产生IL-6、IL-12、TNF-α等一系列炎症因子使机体免疫系统发生改变,破坏机体的细胞免疫功能,引发免疫紊乱[10]。王军等[11]研究发现感染EV71型病毒的HFMD患儿细胞免疫功能紊乱,淋巴细胞亚群失调,细胞免疫防御屏障破坏是导致重症病例的因素之一。T淋巴细胞是人体重要的免疫细胞,主要反应机体的细胞免疫功能状态。T淋巴细胞分为CD4+和CD8+两个亚群,在接受抗原刺激后分泌不同的细胞因子,介导机体产生适度的免疫应答。

共刺激分子OX40/OX40L是TNF超家族的一员,与一系列自身免疫性疾病密切相关,其可以促进T淋巴细胞的活化、增殖及存活,并调控B细胞的活化、增殖及凋亡,参与炎症的发生。OX40/OX40L共刺激信号可通过Th2、Th17等多种途径参与免疫应答[12]。有研究显示OX40与CD4+自身反应性T细胞的活化有关,CD4+T细胞经活化可以表达OX40分子,OX40也可反向维持CD4+T细胞的存活,使CD4+T细胞向炎症部位聚集增强炎症反应,同时OX40/OX40L也会出现共表达的现象[13]。

本研究结果显示,HFMD患儿外周血中OX40、OX40L的表达水平升高,提示OX40、OX40L可能参与了HFMD的发病过程,OX40共刺激信号在HFMD患儿的免疫进程中与CD4+辅助性T细胞的活化有关。抗原提呈细胞上OX40L与CD4+T细胞上OX40结合后,可阻断CD4+效应T细胞向Treg细胞的转化,表达上调的OX40可干扰CD4+效应T细胞向Treg细胞分化,导致Treg细胞数量减少,加重炎症反应[14]。本研究中重症组HFMD患儿OX40和OX40L的表达水平最高,进一步验证了OX40和OX40L可增强CD4+T细胞的共刺激信号,使自身反应性T细胞异常活化,产生神经系统的损害等重症病例,临床上表现为脑干脑炎、神经源性肺水肿等。IL-6是启动抗炎反应的关键细胞因子,能使炎症反应处于持续激活放大的状态,有效阻断机体的免疫损伤[15]。本研究中HFMD患儿外周血IL-6水平高于对照组,与上述研究[15]一致。本研究中重症组与轻症组WBC差异不显著,考虑可能与入组患儿病程、年龄及抽血时间距发病时间等有关。

在对OX40和OX40L的表达与PCIS的相关性分析中发现,HFMD患儿CD4+T细胞表面OX40的表达与PCIS有相关性,CD14+单核细胞表面OX40L的表达与PCIS无相关性,可能与OX40、OX40L信号对T细胞的作用机制有关。在非抗原依赖途径中,OX40自身反应性T细胞与OX40L的依赖程度下降,同时OX40L主要在活化的抗原提呈细胞表面诱导性表达,其表达时相也是在细胞活化后24～48 h出现,考虑OX40L在免疫损伤中不占主要地位,从而与PCIS无明显相关。本研究结果显示,OX40诊断重症HFMD的效能最高,进一步验证OX40与重症HFMD的发病密切相关,可作为重症HFMD的预测指标之一。

综上所述,HFMD患儿外周血中OX40、OX40L的表达水平升高,在HFMD的诊断中具有一定的临床应用价值,其中OX40与疾病的严重程度密切相关,提示该共刺激分子参与了HFMD的发病及免疫进程,可作为重症HFMD的预测指标之一,对早期识别重症HFMD患儿具有重要意义。