李 涛，张 玺，张晓妮

（临沂市疾病预防控制中心细菌检验科，山东临沂 276000）

沙门菌是导致人类和动物胃肠炎和腹泻的最常见病原体之一，其中鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）在全球沙门氏菌感染中占很大比例[1]。鼠伤寒沙门菌单相变异株由于编码基因（如fljA、fljB或hin）的缺失，导致沙门菌第二相鞭毛蛋白表达方面产生缺陷[2]。近年来，欧洲、美国和亚洲的临床分离株中，鼠伤寒沙门菌单相变异株I4,[5],12:i:-大幅增加，其流行趋势已成为全球公众关注的问题[3]。

2020年4月，山东省临沂市某机构发生一起食源性疾病暴发事件，患者主要表现为发热、腹泻并伴有恶心、呕吐、腹痛等症状。由于该机构相对封闭，患者有明确的共同就餐史，结合临床表现及血常规检测结果，判断为细菌性食源性疾病事件，随后采集可疑样本至实验室进行检测。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

采集样本包括患者粪便17份，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子24份。

沙门菌诊断血清（丹麦SSI）；XbaI限制性内切酶（大连TaKaRa）；革兰氏阴性菌药敏检测板(上海复星）；沙门菌血清型分子鉴定试剂盒（山东美正）；标准菌株H9812及ATCC25922均来自山东省疾控中心。

荧光PCR扩增仪（美国赛默飞）；全自动微生物分析系统VITEK2（法国梅里埃公司）；CHEFMAPPER脉冲场凝胶电泳仪及成像系统和全自动凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR检测

使用商品化试剂盒应用Realtime PCR法对采集到的粪便样本进行沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和致泻大肠埃希氏菌的多病原检测。

1.2.2 致病菌的分离及鉴定

粪便样本参照《感染性腹泻诊断标准》（WS 271—2007）进行分离培养，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子样本按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）要求进行检测。

1.2.3 菌株血清型鉴定

使用沙门菌血清型分子鉴定试剂盒和沙门菌诊断血清鉴定分离株血清型。

1.2.4 药敏试验

采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC），按照商品化药敏检测板说明书进行具体操作和结果判读，使用标准菌株ATCC25922作为质控对照。

1.2.5 脉冲场凝胶电泳分型

参照国家致病菌识别网沙门菌PFGE分子分型方法，以H9812为标准Marker。限制性内切酶XbaI进行酶切，经电泳、染色，获得图谱，上传至国家致病菌识别网平台进行聚类分析。

1.2.6 全基因组测序分析

使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0试剂盒提取分离株核酸后，送诺禾致源生物信息科技有限公司进行全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）。测序数据采用Center for Genomic Epidemiology（http://www.genomicepidemiology.org/）在线分析工具，预测沙门菌血清型[4]、ST型别[5]、耐药表型及耐药基因[6]，基于VFDB（Virulence Factor Database）数据库[7]对沙门菌分离株毒力基因进行注释分析。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR鉴定结果

结果显示11份患者粪便沙门菌基因检测阳性，食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子样本检测结果均为阴性。

2.2 分离鉴定及血清分型结果

41份流调样本共分离沙门菌7株，编号分别为SDLY20Sal001、SDLY20Sal002、SDLY20Sal003、SDLY20Sal004、SDLY20Sal005、SDLY20Sal007和SDLY20Sal011，均来自患者粪便样本。食品、餐具及食物制作器具涂抹拭子样本增菌培养后，沙门菌检测结果均为阴性。分离株经沙门菌血清型分子鉴定试剂盒鉴定为鼠伤寒沙门菌，诊断血清凝集结果为4,12:i:-，WGS测序数据预测血清型为I4,[5],12:i:-，其ST型为34。

2.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）结果

7株分离株的PFGE带型一致，判断此次事件中患者感染同一鼠伤寒沙门菌，该分离株与临沂市2019年收集的两簇鼠伤寒沙门菌相似度只有47.56%和35.33%（图1）。

图1 7株鼠伤寒沙门菌PFGE聚类分析图谱

2.4 药物敏感试验及WGS耐药基因分析结果

药物敏感试验结果显示，本案例沙门分离株对氨苄西林、四环素、链霉素、多西环素及米诺环素耐药，ResFinder4.0预测分离株携带6个耐药基因，分别是氨基糖苷类耐药基因[aac（6’）-Iaa、aph（6）-Id、aph（3’’）-Ib]、β-内酰胺类耐药基因（blaTEM-1B）、磺胺类耐药基因（sul2）及四环素类耐药基因tet（B）。阿米卡星、氨苄西林-克拉维酸钾及磺胺甲恶唑3种抗生素药敏试验与WGS耐药表型预测不同（表1）。

表1 药物敏感试验及WGS耐药性预测分析结果

2.5 毒力基因分析结果

基于VFDB数据库分析本案例分离株WGS测序数据共注释110个毒力基因，其中101个毒力基因可根据文献中描述的沙门菌属致病的4个关键阶段[8]进行分类（表2）。与附着相关毒力因子有bcf、csg、fim、lpf、shd、mis，与侵袭/细胞内存活相关毒力因子有inv、org、pip、prg、sic、sif、sip、ssp、slr、sod、sop、sig、spa、spt，与巨噬细胞内存活相关毒力因子有mgt、spi、ssa、ssc、sse、srf，未比对出与系统传播相关毒力因子，前3个阶段对应毒力基因数量分别是26、40及35。

表2 沙门菌致病机制4个已知步骤的毒力基因分布情况

3 结论与讨论

我国鼠伤寒沙门菌分离株中鼠伤寒沙门菌单相变异株占32.67%，自2011年来呈上升趋势，尤其值得注意的是其中儿童感染病例占63.29%[9]。由于传统血清分型方法局限[3]，本案例最终通过WGS数据分析确定分离株血清型，引起该事件的沙门菌是鼠伤寒沙门菌单相变异株I4,[5],12:i:-，结合PFGE分子分型结果，判定该分离株为引起本次事件暴发的致病菌。

我国沙门菌分离株常见耐药基因多与磺胺类、β-内酰胺类、四环素类和酚类抗生素相关，最常见的耐药基因是aph（3’）-IIa、blaCTX-M-55和blaTEM-1B，药敏实验结果和基于WGS的表型预测结果往往高度一致[9]，基于WGS的耐药表型预测在指导临床用药方面有广阔的应用前景。本案例分离株药敏试验结果中阿米卡星及磺胺甲恶唑2种抗生素与WGS耐药表型预测不同，耐药基因分析结果显示存在与2种抗生素对应的耐药基因，提示可通过分析这2个耐药基因序列，进一步探寻其耐药机制。

GAO等[10]按照与沙门菌发病相关的4个关键阶段，即附着、入侵、巨噬细胞内存活和系统传播，对227个沙门菌属毒力基因进行分类，4个阶段对应的毒力基因数量分别是49、73、39和66。毒力相关基因中，目前共发现129种不同的毒力因子[9]。刘理慧等[11]提出一般菌株的致病性越强，其携带的毒力基因的种类和/或数量越多。结合本案例毒力基因预测结果推测，该鼠伤寒沙门菌单相变异株致病性相对较弱，引起全身感染性疾病表现概率较低。

在食源性疾病事件调查中，多病原筛查PCR技术能够与传统培养方法互补，实现病原的快速确定，缩短实验室检测时间，对流行病学调查有积极的指导意义；PFGE分子分型技术则一直是致病菌溯源分析的“金标准”，而全基因组测序技术能为分析病原的毒力基因、耐药基因及分子溯源提供更多的病原学信息。全基因组测序技术还可以用于预测与毒力、生存压力或微生物耐药性相关的各种遗传特征，这对改善食品安全管理和公众健康有很大益处。