张明玉，卢志锋

（1.葫芦岛市检验检测中心，辽宁葫芦岛 125000；2.齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔 161000）

白地霉是真核微生物，形态特征介于酵母菌和霉菌之间，具有生态适应性强、生长速度快的属性，在土壤、泡菜中分布广泛[1-2]。酸菜是一种含有丰富乳酸菌的腌渍蔬菜制品。酸菜采用自然接种发酵工艺，除了含有优势菌群外还富含其他菌体，以传统生理生化方法与分子生物学方法对白地霉进行分离菌株鉴定，为多角度开发利用东北酸菜中的微生物资源，发展相应微生态制剂及深入研究其开发利用价值奠定基础[3]。本文主要研究自然发酵酸菜中白地霉的分离与鉴定，通过观察菌落形态以及PCR扩增技术对菌种进行一系列的鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

蒸汽灭菌器、DRP-9052电热恒温培养箱、X52-G显微镜、HZQ-QX恒温振荡器、离心机、pH计、分光光度计；缓冲液、溶菌酶、20% SDS（十二烷基硫酸钠）、电泳缓冲液。

1.2 实验方法

1.2.1 菌落的鉴定

菌种初筛复筛。取10.0 g自然发酵的酸菜，将其装入含有90 mL无菌水的无菌三角烧瓶中，充分振荡混匀。对混合均匀的上清液进行梯度稀释，即将1 mL上清液装入含有9 mL无菌水的无菌试管中，稀释梯度为10-1，振荡混匀后，在稀释梯度10-1中取1 mL液体，装入含有9 mL无菌水的无菌试管中，稀释梯度为10-2，依次类推。于10-2、10-3和10-4的试管中分别取200 μL液体，涂布于马铃薯培养基中，于30 ℃恒温培养48 h。

将生长良好的菌株划线培养，得到单菌落。挑取单菌落菌种，接种于10 mL无菌生理盐水，梯度稀释后，在10-2、10-3稀释梯度下，取200 μL涂布于马铃薯固体培养基，于30 ℃恒温培养48 h，观察菌落形态。

1.2.2 个体形态的鉴定

在加入乳酸-石碳酸棉兰染液的载玻片中用镊子加入从菌落边缘夹取的少许菌丝体。加盖玻片，放置在显微镜下，观察营养体和繁殖体的特征。

1.2.3 分子生物学鉴定

（1）DNA的提取。使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，具体步骤参照说明书。

（2）PCR扩增。PCR反应体系组成见表1。NL1引物序列为GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG，TM=58.55 ℃；NL4引物序列为GGT CCG TGT TTC AAG ACG G，TM=59.72 ℃。

表1 PCR反应体系组成表

将上述组分加入PCR管中，反应的总体系为25 μL，在PCR仪上进行扩增反应。经梯度PCR实验选定最佳退火温度为54 ℃，反应热循环参数为94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min[4]。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物[5]。扩增结束后，PCR产物-20 ℃保存。采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行目的片段的回收。

（3）测序及Blast处理。由上海生物工程技术服务有限公司纯化PCR扩增产物后测序。将测序结果输入GenBank数据库，利用BLAST软件，与数据库中已发表基因序列进行序列比对，从而最终确定目的基因的同源性。

（4）构建进化树图。通过综合使用Clustalx1.83、BioEdit7.0、Mega 4.13种软件进行建树，虽然单独使用Clustalx也能达到建树效果，但Mega 4.1结果更加细致，因此采用结合使用的方式[6]。

2 结果与分析

2.1 菌落鉴定结果

24 h后观察涂布好的菌落，菌落生长快，呈现白色平面扩散状，较扁平；48 h后观察菌落，呈现短绒状或近于粉状，菌丝体变得紧密整齐，菌丝白色；72 h后菌丝生长开始缓慢，不再向四周扩散，有同心圈可放射线，有的呈中心突起。24 h和72 h后的菌落分别如图1所示。

图1 菌落图

2.2 个体形态鉴定结果

菌丝宽3～6 μm（图2），节孢子大小为（5.5～7.3 μm）×（6.5～15.9 μm）（图3）。

图2 菌丝图

图3 节孢子

2.3 PCR扩增电泳以及回收产物电泳图

由图4（a）可知，26S rDNA的PCR扩增产物目标大小约为600 bp，与本试验结果一致；由4（b）可知，PCR胶回收产物条带清晰可见，可用于后续的实验研究。

2.4 Mega 4.1进化树图

由图5和表2可知，待测菌株G.wang的26S rDNA序列与菌株G.geo.7的18S rRNA的部分序列的同源性可达98%以上，且菌株G.geo.7为白地霉菌属，因此确定目标菌株为白地霉菌株。

图5 26S rDNA白地霉菌株扩增树状图

表2 26SrDNA序列同源性表

3 结论

本实验以东北自然发酵酸菜为菌种来源，从中分离纯化出菌株G.wang，结合其菌落特征和个体形态特征及分子生物学鉴定。结果发现，G.geo.7与G.wang同源性最高，且同源性能够达到99%以上。26S rDNA序列同源性分析结果表明，分离株G.wang结合真菌鉴定手册得知为半知菌亚门-丝孢纲-丝孢目-从梗孢科-地霉属-白地霉种。