谢婷 杨栋 罗银利 郭育君 王杜

慢性失眠是指睡眠障碍持续>6个月,其特征为无法入睡或无法保持睡眠状态,导致睡眠不足。研究显示,失眠是引起认知功能障碍的重要原因之一,尤其是老年人其认知功能损伤的风险增加了近2倍,目前对失眠引起认知功能障碍的发病原因及机制尚不清楚[1]。中医认为慢性失眠认知功能障碍属于“不寐、痴呆”范畴,脑髓空虚是本病的基本病理变化,肾精亏虚是其基本病机[2]。研究表明,肾虚患者大多脑功能下降,大脑神经细胞减少、内分泌功能紊乱、炎性因子和变态反应增加[3,4]。慢性失眠作为原发病在中医病机以阴虚为本,尤以肾阴虚为突出证候特点,其基本病机是“肾阴不足、脑虚髓减”,临床上从“阴虚”论治疗该病效果显著[5,6]。左归丸为滋肾补阴的代表方剂,其所含的熟地、山药、山萸肉、枸杞子、菟丝子、鹿角胶六味药以甘温性味为重,是填精补肾之上品。研究显示左归丸具有很好的的神经保护作用[6,7]。因此,本研究从2021年4月开始,进行为期9周的试验。拟构建睡眠剥夺大鼠模型并给予左归丸干预,探讨左归丸对睡眠剥夺大鼠所致认知障碍的保护作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 D-半乳糖(上海试剂二场),左归丸(北京同仁堂股份有限公司),0.3 g/ml戊巴比妥钠 (上海新亚药业有限公司),丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及BCA蛋白检测试剂盒均购自南京建成科技有限公司,大鼠白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。抗IL-6、抗IL-1β、抗TNF-α、抗NF-κB和抗GAPDH等一抗购自英国Abcam公司,羊抗兔二抗IgG购自上海易利生物科技有限公司。

1.2 动物模型制备及分组 从西斯贝福生物科技有限公司购买40只健康无特定病原体(SPF)级的、体重200 g左右的远交群(SD)雄性大鼠。适应性喂养1周后,随机数字法分为5组,每组8只。采用多平台水环境法构建睡眠剥夺模型[7],自制睡眠剥夺箱,规格1 m × 0.8 m × 0.4 m,将多个圆形小平台置于睡眠剥夺箱内,箱内注水至水面高出平台1 cm,使大鼠可以在平台站立及自由摄食、饮水,在大鼠进入快速眼动睡眠阶段后,会因为骨骼肌松弛掉入水中而惊醒,造成睡眠剥夺,12 h/d,连续4周。造模成功后,分为:对照组:每日灌胃等量的0.9%氯化钠溶液;模型组:每日灌胃等量的0.9%氯化钠溶液;左归丸低剂量组:每日灌胃左归丸水溶液0.9 g/kg;左归丸中剂量组:每日灌胃左归丸水溶液1.8 g/kg;左归丸高剂量组:每日灌胃左归丸水溶液3.6 g/kg;1次/d,连续4周。

1.3 水迷宫实验 Morris 水迷宫分为空间探索实验及定位巡航实验,实验设备由圆形水池(直径120 cm,高60 cm)、可移动大鼠站台 (直径10 cm,高30 cm)、影像收集及分析系统等部分组成。实验时圆形水池水面需没过大鼠站台1～2 cm,水池分成 4 个象限, 将站台放入第一象限定为目标象限。Morris水迷宫共进行 7 d,前 5 d为空间探索实验,将大鼠从第三象限的中间点面朝着水池的池壁放入到水池中,如果大鼠在 60 s的时间内未找到站台,则将大鼠引到站台上停留10 s,统计大鼠上平台潜伏期,游泳总路程。第6天休息,第 7 天撤去平台后开始定位航行实验,记录大鼠60 s内穿越平台次数和目标象限停留时间,评价睡眠剥夺和左归丸对学习记忆的影响。

1.4 ELISA检测 末次实验结束后,腹主动脉取血,离心(3 500 r/min,15 min),收集血清。 检测血液中IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎性因子的水平。

1.5 Western blot检测 称取适量的海马组织,加入裂解液500 ml (RIPA∶PMSF =100∶1),匀浆离心后取上清,使用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。取20 μg蛋白用SDS-PAGE分离胶电泳后将分离的蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别加入抗IL-6(1∶1 000)、抗IL-1β(1∶1 000)、抗TNF-α(1∶1 000)、抗NF-κB(1∶1 000)、抗GAPDH(1∶10 000),4℃孵育过夜。TBST漂洗3次,10 min/次,然后加入二抗羊抗兔IgG室温孵育1 h,TBST漂洗3次,10 min/次,最后加入适量ECL化学发光液,用化学发光仪拍照使用image J对条带进行统计分析。

2 结果

2.1 左归丸对睡眠剥夺大鼠空间探查实验的影响 与对照组比较,模型组大鼠目标象限停留时间显著减少(P<0.05),大鼠穿越平台次数显著减少(P<0.05);与模型组比较,左归丸组大鼠目标象限停留时间显著延长,大鼠穿越平台次数有显著增加,并且左归丸的作用呈剂量相关性(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠空间探查实验比较 n=8,

2.2 左归丸对睡眠剥夺大鼠定位巡航实验的影响 与对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期和游泳总路程显著延长(P<0.05);与模型组比较,给予中等及高剂量的左归丸治疗后大鼠游泳总路程显著减少(P<0.05),给予各剂量的左归丸治疗后大鼠逃避潜伏期显著减少,而左归丸中剂量大鼠逃避潜伏期和游泳总路程显著减少得更显著(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠定位巡航实验比较 n=8,

2.3 左归丸对睡眠剥夺大鼠血清炎性因子水平的影响 与对照组比较,模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,左归丸各给药剂量组大鼠血清中IL-1β,IL-6以及TNF-α水平显著降低,左归丸中剂量大鼠炎症水平降低最显著(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平比较 n=8,pg/ml,

2.4 左归丸对睡眠剥夺大鼠氧化应激水平的影响 与对照组比较,模型组大鼠海马中MDA含量明显增加,(P<0.05)GSH-Px、SOD水平降低(P<0.05);与模型组比较,左归丸组大鼠海马中MDA含量明显减少(P<0.05),GSH-Px、SOD水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 5组大鼠海马中MDA、GSH-Px以及SOD水平检测结果 n=8,

2.5 左归丸对睡眠剥夺大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达的影响 与对照组比较,模型组大鼠海马中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达显著上调(P<0.05);与模型组比较,左归丸各剂量组大鼠海马组织中TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平均有不同程度的下调(P<0.05),左归丸中剂量组TNF-α的蛋白表达水平下调(P<0.05)。见图1,表5。

图1 5组大鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表达水平

表5 5组大鼠海马中中TNF-α,IL-1β和IL-6蛋白相对表达 n=8,

2.6 左归丸对睡眠剥夺大鼠海马组织中NF-κB蛋白表达的影响 对照组大鼠海马中NF-κB蛋白相对表达量为(0.25±0.03),模型组为(0.43±0.04)。与对照组比较,模型组大鼠海马中NF-κB蛋白相对表达显著上调(P=0.003);左归丸低、中、高组大鼠海马中NF-κB蛋白相对表达量分别为(0.41±0.02)、(0.26±0.02)、(0.25±0.03),与模型组比较,左归丸中、高组大鼠海马中NF-κB蛋白表达显著下调(P<0.05)。

3 讨论

慢性失眠现在已经呈现发病逐渐年轻化的趋势,研究发现,睡眠剥夺被认为是认知损伤的独立危险因素,常以记忆力减退及情感障碍为首发症状,但具体分子机制还不是十分明确[8-10]。

中医学认为慢性失眠的病机为阴虚为本,燥热为标,两者互为因果,阴愈虚则燥热愈盛,燥热愈盛则阴愈虚,病变脏腑主要在肺、胃、肾,以肾为关键。慢性失眠的发生发展与肾阴虚衰密切相关。肾为先天之本,主藏精而寓元阴元阳,肾主骨生髓,与脑髓密切相关,阴虚精亏髓减,清窍失充[11,12]。本研究通过构建大鼠睡眠剥夺模型,发现睡眠剥夺可以显著减少大鼠在目标象限停留时间,延长大鼠上平台潜伏期、游泳总路程、初次抵达平台时间,表明睡眠剥夺会损伤大鼠的学习记忆;而经左归丸干预后可以显著增加大鼠在目标象限停留时间,减少大鼠上平台潜伏期、游泳总路程、初次抵达平台时间,该结果表明左归丸能提高睡眠剥夺大鼠的学习记忆,对睡眠剥夺所致的认知障碍有保护作用。

研究发现睡眠剥夺会导致脑部的氧化应激[13]。海马在认知功能中有着重要作用,本实验选取海马组织中相关蛋白表达进行分析,结果显示睡眠剥夺会降低大鼠海马SOD、GSH-Px的活性并产生过量的MDA,而给予左归丸干预后能明显增加SOD、GSH-Px的活性,减少MDA的含量,说明左归丸能提高体内抗氧化功能,降低氧化损伤,防止大分子过氧化。

有研究表明,睡眠剥夺可增加海马IL-1β 表达,引起动物认知功能障碍, 反复睡眠剥夺组TNF-α 的水平明显升高,NF-κB信号途径被激活,而NF-κB 是参与促炎因子生成的物质[14-15]。同时也有研究表明睡眠剥夺可导致小鼠血清 IL-1β,IL-6以及TNF-α 细胞因子水平升高[16]。本实验结果显示,睡眠剥夺组大鼠IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎性因子水平均显著上调,说明睡眠剥夺会促使促炎因子释放,产生炎性反应。而左归丸干预后,左归丸组大鼠与模型组比较IL-1β、IL-6、TNF-α表达都出现显著下调,说明左归丸能够改善睡眠剥夺引起的学习记忆损伤及炎性反应。

睡眠剥夺会诱发炎性反应,NF-κB 是 TNF-α、IL-6 等炎症基因的关键转录调节因子,NF-κB 的活化会促生炎性细胞因子[17-20]。本研究表明,睡眠剥夺组大鼠NF-κB蛋白表达显著上调,说明睡眠剥夺引起了炎性反应;而左归丸干预组大鼠海马中NF-κB的表达下调,说明左归丸能减少NF-κB和促炎因子的表达,调控炎症过程,改善睡眠剥夺引起的学习记忆损伤。

综上所述,本研究通过构建大鼠睡眠剥夺模型,证实睡眠剥夺会导致大鼠认知功能损伤,左归丸可能通过降低睡眠剥夺引起的相关炎性反应,增加其抗氧化功能,从而改善睡眠剥夺所致的认知损伤。