宋晓东,吴秋月,朱培冉,刘雪艳1,,周宏健,李卫巍,夏欣一(1.江苏大学医学院,江苏镇江 1013;. 中国人民解放军东部战区总医院全军临床检验医学研究所,南京 1000;3. 连云港市第一人民医院检验科,江苏连云港 000)

角膜营养不良症是一组少见的且与家族性遗传相关的原发性双侧致盲性角膜疾病,患者一般伴有眼部疼痛、有刺激症状、暂时性视力模糊、视力下降、虹视和雾视等临床症状。目前,在约50%的角膜营养不良病例中发现了特定的遗传背景。现已证实有33个致病基因与角膜营养不良有关,包括角蛋白(keratin 3,KRT3)、磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol-3-phosphate5-kinase type,PIP5K3)、锌指蛋白1(zinc finger protein 1,ZFP1)、转化生长因子β诱导基因(pransforming growth factor beta inducer gene,TGFBI)等[1]。研究证实,颗粒状角膜营养不良、Thiel-Behnke角膜营养不良、Reis-Bücklers角膜营养不良和格子状角膜营养不良等均可由TGFBI基因突变引起,这些疾病均以常染色体显性遗传方式遗传[2]。角膜营养不良相关致病基因的分子遗传学研究对临床诊断起到积极的指导作用。

1 资料与方法

1.1临床资料 先证者(Ⅲ-1),男,42岁,因3年前出现角膜炎反复发作,左眼视力渐进性下降,于2016年7月中国人民解放军东部战区总医院眼科就诊。患者偶有眼部不适,无恶心呕吐、头痛、头晕,无黑影飘动、视物变形、暗点、视野缺损、无眼前闪光感、眩光、眩晕等现象。左眼视力0.02,双眼结膜无充血,前房深浅正常,房水清,虹膜纹理清,色正常,瞳孔圆,直径2.9 mm,对光反射灵敏,晶体尚透明,眼底窥视不清,裂隙灯下角膜中央部呈轻度弥漫性混浊,上皮层有不规则的分支状白色细条和混浊点,交织成网络状,临床确定诊断为格子状角膜营养不良。先证者奶奶(Ⅰ-2)、父亲(Ⅱ-1)也伴有视力下降等眼部不适。家系中的患者除上述眼部角膜异常外,均无其他全身疾病或异常。家系内正常成员未检出眼部及其他相关系统疾病。本研究经中国人民解放军东部战区总医院医学伦理委员会审核批准(2023DZGZR-035),各研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集及DNA提取 使用EDTA-K2抗凝采血管通过肘部静脉采血的方式采集家系成员血液样本3 mL,按照DNA提取试剂盒说明书提取外周血DNA样本,并置于-80 ℃保存。

1.2.2全外显子组测序 将先证者DNA样本送至北京智因东方转化医学研究中心公司进行全外显子组高通量测序。用Burrow-Wheeler比对工具将测序读数与人类参考基因组(HG19/GRCh37)进行比对。利用Verita Trekker@变异位点检测系统和Enliven@变异位点注释解读系统对数据进行分析。

1.2.3PCR扩增 查询美国国立生物技术信息中心官方网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取TGFBI全基因序列,用Primer Premier 5.0软件设计TGFBI基因4号外显子和8号外显子的引物序列,Exon 4上游引物序列:5′-CCCCAGAGGCCATCCCTCCT-3′,下游引物序列:5′-CCGGGCAGACGGAGGTCATC-3′,扩增产物大小为225 bp,引物Tm值为56.5 ℃;Exon 8上游引物序列:5′-GTGACCTGAGTCTGTTTGG-3′,下游引物序列:5′-GAAGTCGCCCAAAGATCTCT-3′,扩增产物大小为342 bp,引物Tm值为52 ℃。引物均由上海华大基因公司合成。以基因组DNA为模板扩增TGFBI基因。PCR反应混合物为25 μL,包括10×缓冲液2.5 μL,2.5 mmol/L MgCl21.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL, 700 ng/L DNA模板2 μL, 5 U/μL Taq聚合酶0.25 μL, ddH2O 14.75 μL。循环参数:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,57～62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃延伸7 min。PCR反应结束后,通过20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物,采用凝胶电泳成像系统检测目的片段大小,以判定目的PCR产物。

1.2.4Sanger测序及序列比对 取PCR产物送深圳华大基因测序公司进行突变位点的Sanger测序,使用BLAST序列分析工具将测序结果与GenBank中记录的野生型TGFBI基因序列进行比较,确定突变位点。

2 结果

2.1先证者家系遗传特征 角膜营养不良症在该家系中世代连续传递,系谱分析符合常染色体显性遗传的特征,见图1。

注:□为男性,○为女性,■为男性患者,●为女性患者,↗为先证者。图1 先证者家系图谱

2.2全外显子组测序结果 经测序后发现,先证者TGFBI基因(位于5号染色体)有2个与角膜营养不良相关性较高的变异,其中1个变异是4号外显子c.370C>T(p.R124C)杂合突变,即TGFBI基因的第370位碱基由C变为T,密码子由CGC变为TGC,编码第124位氨基酸由精氨酸R变为半胱氨酸C;另1个变异是8号外显子c.1007A>T(p.E336V)杂合突变,即TGFBI基因的第1 007位碱基由A变为T,密码子由AGC变为TGC,编码第336位氨基酸由谷氨酸E变为缬氨酸V,见表1。

表1 先证者全外显子组测序结果

2.3Sanger测序验证 先证者在TGFBI基因上发生c.370C>T(p.R124C)和c.1007A>T(p.E336V)2个杂合突变。先证者父亲(Ⅱ-1)、家系其他家系成员(Ⅰ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-7、Ⅱ-9、Ⅲ-1、Ⅲ-3、Ⅲ-7、Ⅲ-11、Ⅲ-14、Ⅳ-2)患者通过Sanger测序仅发现了TGFBIc.370C>T(p.R124C)杂合突变。先证者母亲和其余家系正常成员经Sanger测序未检测出TGFBI基因突变(图2、3)。

注:A,先证者(Ⅲ-1)Sanger测序图;B,先证者父亲(Ⅱ-1)和家系其他患者Sanger测序图;A、B均提示TGFBI基因4号外显子c.370C>T杂合突变;C,先证者母亲(Ⅱ-2)和家系正常成员Sanger测序图,提示TGFBI基因4号外显子无突变。图2 TGFBI基因4号外显子c.370C>T(p.R124C)位点验证

注:A,先证者(Ⅲ-1)Sanger测序图,提示TGFBI基因8号外显子c.1007A>T杂合突变;B,先证者父亲(Ⅱ-1)和家系其他患者Sanger测序图,提示无突变;C,先证者母亲(Ⅱ-2)和家系正常成员Sanger测序图,提示无突变。图3 TGFBI基因8号外显子c.1007A>T(p.E336V)位点验证

3 讨论

TGFBI基因是由Skonier等[3]首次分离出来的,并被其鉴定为人肺腺癌细胞系中转化生长因子β诱导基因,位于第5号染色体的长臂上(5q31),所编码的蛋白质在皮肤和角膜组织中起重要作用。自Munier等[4]首次报道TGFBI基因突变导致常染色体显性遗传角膜营养不良,目前已发现多种不同突变与角膜营养不良有关[1]。TGFBI基因连锁角膜营养不良的典型临床表现为双侧眼角膜透明度逐渐丧失,常导致角膜糜烂复发,视力受损[5]。本研究中先证者和家系中其他患者的症状也验证了该报道的结果。

本研究中先证者检出TGFBIc.370C>T(p.R124C)杂合突变,与既往报道角膜营养不良突变基因检测的研究结果[6-7]相吻合,提示R124代表了常染色体显性角膜营养不良患者基因组中的突变热点。TGFBIc.370C>T(p.R124C)杂合突变通常为常染色体显性遗传,即代表父母一方至少有一人是该基因携带者,或是该患者自身基因发生了突变。本研究对先证者父母及其家系成员进行了基因检测,其父亲和家系中患者为TGFBIc.370C>T(p.R124C)杂合突变信息携带者,而其母亲和家系中健康成员基因检测未见该突变,由此可判断遗传共分离。上述结论得到了国内另一项研究的支持[8],该研究报道了中国3个家系患者均存在TGFBI基因突变且均发生在密码子R124位点,TGFBI基因突变与疾病表型在3个家系中共分离。本研究中先证者的基因检测还显示了TGFBIc.1007A>T(p.E336V)杂合突变,但是在Sanger测序验证中,该家系其余患者均未检测到此基因突变,因而TGFBIc.1007A>T(p.E336V)突变在家系中不存在与表型共分离现象,排除其致病可能性。

目前角膜营养不良的发病机制尚不清楚,其可能的解释是突变位点导致TGFBI基因编码的角膜上皮素(kerato-epithelin,KE)构象改变,从而发生酶解反应,其降解产物诱导角膜成纤维细胞凋亡,异常角膜自噬功能不良,不能清理KE蛋白或其降解产物,从而导致病理性淀粉样蛋白沉积物特异性在角膜堆积,引起一系列临床症状[9]。Kitamoto等[2]建立TGFBI-R124C突变小鼠模型以表征人类角膜营养不良,结果发现TGFBI蛋白在纯合子TGFBI-R124C突变小鼠的角膜沉积显著增加,证实了该突变蛋白的致病作用;小鼠角膜上皮伤口愈合明显延迟,解释了角膜营养不良患者角膜上皮反复糜烂的表现。

综上所述,本研究通过对1个角膜营养不良家系进行突变鉴定,发现了TGFBIc.370C>T(p.R124C)杂合突变是导致该家系发病的原因。该病例丰富了江苏地区角膜营养不良基因变异与临床表型谱,基因检测为角膜营养不良症的遗传咨询和产前诊断以及未来可能开展的基因治疗提供了依据[10]。本研究尚有不足之处,未来仍需要探寻TGFBI基因突变导致角膜营养不良症形成和病程发展的机制。