王雪亮,胡晓波(上海市临床检验中心质控品研发室/分子生物学室,上海 200126)

肿瘤严重危害人类健康,是导致人类死亡的主要原因之一[1]。早期诊断并及时治疗对于提高肿瘤治疗效果和患者生存率至关重要。目前,组织活检仍是肿瘤检测的重要方式,但其仍存在诸多局限性,例如有创且易导致并发症以及肿瘤组织存在异质性等[2]。液态活检可通过检测体液样本中的核酸和蛋白质等标志物,从而反映肿瘤分子特征和动态变化,因其具有无创便捷、可反复取样和依从性高等优点而受到广泛关注[2]。然而,目前用于液态活检的检测方法普遍具有成本高、耗时长和需要复杂设备等缺点,这限制了其在临床上的广泛应用。因此,急需一种低成本、简单快速且高效准确的肿瘤诊断新方法。

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)系统是一种原核生物抵御外源核酸入侵的适应性免疫防御系统,其已被广泛用于基因编辑和核酸检测中[3-6]。当前CRISPR核酸检测平台中Cas9、Cas12、Cas13是最常用的效应蛋白[3-4,6]。与其他Cas蛋白不同,Cas12具有靶标DNA激发的针对单链DNA的非特异性反式切割活性,基于其持续信号放大和单碱基分辨能力,已被用于高效且特异地检测多种肿瘤标志物[3,6]。笔者就CRISPR/Cas12系统在肿瘤检测中的应用进行综述,以期为CRISPR/Cas系统更好地应用于肿瘤筛查和诊断提供参考及借鉴。

1 CRISPR/Cas12系统简介

CRISPR/Cas系统依据Cas蛋白组成及其发挥作用方式不同分为两大类:第一类主要特征为效应复合物,由多个Cas蛋白组成;第二类则只有1个大分子量、多结构域的Cas效应蛋白单体,包括Cas9、Cas12和Cas13,因其操作方便且简洁高效,因而更适用于基因编辑应用[7]。

与Cas9蛋白不同,Cas12(又称Cpf1)缺乏HNH结构域,但可单独利用其RuvC结构域实现对靶标DNA的切割(图1)[8]。Cas12a可在CRISPR RNA(crRNA)引导下识别位于靶标核酸5′端富含胸腺嘧啶(T)的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif,PAM),从而启动对靶标DNA的切割(顺式切割),同时它还可不加选择地切割反应体系中的非靶标单链DNA(反式切割)[3,6]。随后,V型Cas蛋白的其他亚型也相继被证实具有反式切割活性,如Cas12b[9-10]、Cas12c[11]、Cas12f(Cas14)[5]等。基于此特性,已有多种基于CRISPR/Cas12的性能优良的核酸检测平台被开发出,并广泛用于病原体、肿瘤和转基因作物等领域[3,5-6,9-11]。

图1 CRISPR/Cas12a系统靶向识别切割和反式切割示意图

2 CRISPR/Cas12系统在肿瘤核酸检测中的应用

2.1循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)检测 ctDNA含有肿瘤相关遗传信息,可代替肿瘤组织用于用药指导、耐药监测和预后评估等,是一种具有良好应用前景的液态活检标志物[12]。但ctDNA含量稀少,呈高度碎片化且半衰期极短,这对检测方法带来了极大挑战。当前ctDNA检测方法操作复杂、价格昂贵,不能有效满足临床需求[12]。随着CRISPR技术快速拓展,可利用Cas13和Cas12开发操作简单、成本便宜且灵敏特异的检测平台。虽然Cas13a更早被用于ctDNA样本检测[4]。但当检测靶标DNA时,CRISPR/Cas13需增加DNA到RNA的体外转录环节,这造成操作上的不便,因此CRISPR/Cas12更适用于ctDNA检测。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变检测对于肺癌患者用药指导和疗效监测等具有重要作用。Feng等[12]将CRISPR/Cas12a和滚环扩增技术相结合开发了一种新的EGFR19del检测方法,其检测灵敏度可低至20 fmol/L,并可通过裸眼观察判定反应结果。Liu等[13]构建了基于CRISPR/Cas12a和Fe3O4磁性纳米复合材料的电化学传感器,证实其对EGFRL858突变位点检测具有高度的特异性、稳定性和选择性。该方法检出限可低至3.3 amol/L,并成功用于临床样本检测。笔者利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)引物引入PAM位点解决了Cas12a检测靶标序列无PAM位点问题,并通过单双碱基错配方式提高其检测的特异性[14]。并进一步证实改良的CRISPR/Cas12a系统具有极高的灵敏度和选择性(0.02%),可在50 min内精准鉴定EGFRT790M和L858R突变。此外,BRCA1基因突变与女性乳腺癌的发生和发展有着密切关系。Choi等[15]将Cas12a反式切割活性和DNA功能化金纳米颗粒结合开发了一种无扩增策略的生物传感器,可在30 min内实现BRCA1基因的比色检测,检出限可低至0.34 fmol/L。

2.2循环肿瘤微小RNA(miRNA)检测 miRNA是一类长度只有20～23个核苷酸的小RNA,在肿瘤组织中异常表达[16]。相对于组织样本,体液中更易实现miRNA的识别与分离,可作为肿瘤诊断和监测的重要途径。因此,开发基于CRISPR的快速、廉价、敏感、特异的miRNA检测方法对于肿瘤的早发现、早治疗具有重要意义。

miR-17和miR-155在多种肿瘤细胞中高表达,如乳腺癌和肺癌等。Jia等[17]将杂交链式反应和CRISPR/Cas12a结合构建成1个多功能的miRNA检测平台,可用于miR-17和miR-155的检测,且其检出限可低至0.29 fmol/L。miR-21在多种肿瘤中高表达,在肿瘤的发生、发展中具有重要作用。Wang等[18]利用滚环转录将miRNA转变为1条带上有多个pre-crRNA重复序列的长单链RNA,其可被Cas12a主动招募剪切并激活其反向切割活性,从而释放荧光信号。该方法具有灵敏度高和通用性强等优点,且可实现在真实样本中用于miR-21检测。miRNA let-7a是一种肿瘤抑制因子,其表达下调与某些肿瘤相关,如卵巢癌、胃癌等。Wang等[19]将茎环适配器与let-7末端结合后,利用反转录PCR对其进行扩增,扩增产物被Cas12a识别切割后激活Cas12a的反式切割活性,非特异性地切割荧光报告DNA,从而释放荧光信号。

2.3DNA甲基化检测 DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,DNA甲基化异常被发现与肿瘤等疾病有关[20]。因此,建立灵敏且可靠的甲基化检测方法对于研究肿瘤发生机制并建立有效的诊疗策略具有重要意义。

胶原蛋白α2(I)启动子区DNA高度甲基化情况存在于多种肿瘤中。Li等[9]将基于CRISPR/Cas12b开发的系统用于胶原蛋白α2(I)启动子区M3甲基化位点检测,证实其可对靶标DNA甲基化程度进行快速且准确地定量。SEPT9基因甲基化(mSEPT9)可作为一种诊断宫颈癌的特异性生物学标志物。Xu等[21]将RPA和CRISPR/Cas12a联用开发出一种高灵敏和特异性检测mSEPT9的新方法,其检出限约为1 copy/μL,且可从高浓度背景基因组中检出0.01%的mSEPT9。RASSF1A启动子区域高度甲基化可作为乳腺癌诊断和治疗的生物学标志物。Zhou等[22]开发了一种基于内切酶辅助且无PAM依赖的RPA与CRISPR/Cas12a耦合的新型策略。受益于酶切的特异性、Lambda辅助的RPA高效扩增及CRISPR/Cas系统的自我扩增能力,该方法具有极优的灵敏度和选择性,可检测低至0.05%的RASSF1A甲基化DNA。此外,该方法不仅可通过荧光法进行检测,还可通过侧流层析试纸条满足即时检测(point-of-care testing,POCT)需求。

2.4病毒核酸检测 病毒感染与肿瘤的发生、发展紧密相关。持续的高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是导致宫颈癌发生的主要原因,及时准确地进行早期 HPV 诊断和分型对于宫颈癌的防控具有重要意义。HPV很难用传统的病毒培养及血清学技术检测,目前主要采用核酸检测方法。基于CRISPR/Cas12独特的反式切割能力,Chen等[3]首次将CRISPR/Cas12a和RPA结合开发出快速灵敏的DETECTR方法,可在1 h内对HPV16和HPV18进行准确基因分型。Teng等[10]证实CRISPR/Cas12b也可用于HPV16和HPV18的检测与分型,且比CRISPR/Cas12a具有更高的检测灵敏度。为满足POCT需求,Tsou等[23]构建了金纳米颗粒辅助的CRISPR/Cas12a检测平台,可通过裸眼直接观察HPV16和HPV18核酸检测结果,不仅方便快捷,且成本低廉。

此外,乙肝病毒感染可导致肝癌,核酸检测是鉴别其感染、判断预后和监测疗效的重要手段。Ding等[24]将CRISPR/Cas12a和环介导等温扩增技术联用,开发出用于乙肝病毒感染的快速检测系统,其可通过荧光法在13 min内完成实时高敏检测,还可利用试纸条在20 min内完成可视化检测,且检测灵敏度可达1 copy/μL。同样,因EB病毒能导致淋巴瘤及鼻咽癌,Yuan等[25]将PCR和CRISPR/Cas12a联用,所开发的侧流层析试纸条可方便、快速地完成EB病毒的POCT检测。

3 CRISPR/Cas12系统在肿瘤蛋白标志物检测中的应用

3.1常规肿瘤蛋白标志物检测 肿瘤蛋白标志物主要是由肿瘤细胞分泌释放到体液中的抗原、酶和激素等物质,其常在肿瘤患者中呈过量表达。因此,检测其含量对于肿瘤的早期诊断、病情监测和预后判断等具有重要意义[26]。ELISA法是检测肿瘤蛋白标志物的最常用方法,但其存在检测灵敏度低等问题,因此需要开发更为灵敏的检测方法。

转化生长因子β1是肝癌发生的重要细胞因子,可作为肝癌诊断的特异生物学标志物之一。Dai等[27]首次构建了基于CRISPR/Cas12a的蛋白检测平台,该平台将核酸适配体与靶标蛋白结合后,适配体作为Cas12a的识别底物启动其反式切割活性。该方法可成功用于转化生长因子β1检测,且具有良好的灵敏度和特异性。甲胎蛋白是诊断原发性肝癌重要的辅助指标之一。Zhao等[28]开发了1个基于CRISPR/Cas12a的可用于检测蛋白质分析物的检测新平台。该平台可利用适配体/带有PAM位点的双链DNA/生物素标记的单链DNA复合物用于临床样本中甲胎蛋白检测,其检出限为0.07 fmol/L。此外,癌胚抗原对于多种肿瘤的早期诊断、疗效监测和预后判定都具有重要临床意义。Li等[29]将具有多个识别区域的环状DNA Walker和CRISPR/Cas12a结合,开发出可用于多种靶标物质检测的技术平台,这进一步拓展了CRISPR/Cas12的应用场景。

3.2外泌体中蛋白质标志物检测 外泌体是表面呈凹半球状的类囊泡小体,可从血液、尿液及脑脊液等体液中分离得到,其内部包含核酸、蛋白质和脂质等多种物质,可反映母体细胞状态[30]。外泌体在肿瘤形成、生长、转移和耐药中起关键作用,因此可作为肿瘤个体化诊疗的有效生物学标志物[30]。因外泌体在体液中含量极低,故需要使用高灵敏度检测方法进行检测。

CRISPR技术的快速发展为外泌体检测提供了新的思路和手段。Li等[31]开发了基于CRISPR/Cas12a的高灵敏鼻咽癌CD109+外泌体检测平台。该方法检测灵敏度可达100 particles/mL,但其涉及ELISA和PCR等环节,操作复杂且所需时间较长。因此,直接使用适配体分离纯化外泌体可简化相关操作。如Zhao等[32]利用带有阻断器的适配体捕获CD63+外泌体,两者结合后适配体构象发生改变而释放阻断器,上清中的游离阻断器可激活Cas12a的反式切割活性,进而释放荧光信号,从而实现靶标外泌体的检测。该法无需预扩增,可有效简化操作,缩短反应时长。此外,CRISPR/Cas12还可用于外泌体相关物质检测,如蛋白质等。Xing等[33]使用抗体包被磁珠捕获外泌体,与适配体结合后经扩增产生可被Cas12a识别切割的长重复片段,然后非特异性切割体系中的荧光探针释放荧光信号。该平台可成功用于临床样本中外泌体表面蛋白nucleolin和程序性死亡配体1的定量检测。

4 总结与展望

作为新一代可拓展性检测技术,CRISPR/Cas系统开创了核酸检测新时代。本文对CRISPR/Cas12的结构及作用机制进行了简介,并对基于CRISPR/Cas12所开发的多种肿瘤标志物检测平台进行了详细阐述。该系统表现出灵敏度高、特异性好、操作简单和成本低廉等优势,并可实现快速POCT的目的,这突破了传统肿瘤检测技术的局限性,在肿瘤检测领域展现出巨大的应用潜力和前景。

但目前基于CRISPR/Cas12的肿瘤标志物检测技术仍面临不少挑战:(1)大多数方法需与核酸扩增技术(如RPA)相结合以提高检测灵敏度。但该过程仍需分步进行,这极大增加了检测时间和工作量。虽已有研究开发了无扩增核酸检测平台,但仍存在检出限较低问题。应进一步探索可整合等温扩增及信号输出的一体化设备以改进其临床应用。(2)PAM序列限制。绝大多数Cas12识别靶标序列高度依赖PAM序列,这限制了其检测的通用性。除通过扩增引物引入PAM序列外,今后还需寻找更多非严格依赖PAM位点的Cas蛋白,以增加其检测的灵活性。(3)脱靶效应。即由于crRNA与非靶标序列结合而发生脱靶切割,从而导致出现假阳性结果。可通过crRNA的精心设计以提高靶向切割效应,从而保证检测结果的准确性。(4)高通量检测。大多数基于CRISPR/Cas12的检测平台只能实现对单一肿瘤标志物的定性检测。因肿瘤与多种生物学标志物浓度变化情况紧密相关,故需进一步开发可完成高通量快速检测与定量检测的通用平台。综上所述,通过对基于CRISPR/Cas12的肿瘤标志物检测平台的不断优化完善,特别是随着材料学及交叉学科的迅速发展,CRISPR/Cas12系统在肿瘤检测领域将会展现出良好的应用前景和开发价值,有望在肿瘤早期诊断、疗效监测、用药指导和预后判断等方面发挥重要作用。