雷 雨，郑 洋，谢等等，杨晓星

（1. 甘肃定西市食品检验检测中心，甘肃 定西 743000；2. 河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山 467000；3. 长江大学 生命科学学院，湖北 荆州 434000）

亚麻（Linum usitatissimum） 又称壁虱胡麻、鸦麻或胡麻等，隶属于亚麻科亚麻属。为一年生草本植物，分为纤维用、油用和油纤兼用3 种类型。亚麻籽中含有对人体有益的α -亚麻酸、蛋白质、膳食纤维、酚类物质等多种功能成分[1]，在预防心血管疾病和癌症，以及降低骨吸收率、抗炎、抗抑郁等方面均具有重要作用[2-4]。亚麻籽的主要成分是油（30%～40%） 和蛋白（约20%），还有一定量的亚麻籽胶、木脂素、抗维B6因子和毒性物质生氰糖苷等[5]。亚麻籽油中含有十几种环肽，总含量为0.5～2.0 mg/g[6]，环肽是亚麻籽油重要的副产物，与普通直链小分子肽相比，环肽化学性质更稳定，在体外具有广谱、高效的抗菌活性及其他一些生理活性，如抗肿瘤、消炎、护肝等，应用前景广阔[7]。

肽类化合物在广义上是指以酰胺键形成的一类化合物，狭义是指以氨基酸肽键形成的一类化合物，根据肽键的结构可以分为直链肽和环肽[3]。环肽在自然界中广泛分布，动物、植物、真菌、细菌和海洋生物中都含有特殊结构环肽。天然的环肽中常含有非常罕见氨基酸，如D -氨基酸、β -氨基酸和α, β -二脱氢氨基酸等，主要分为杂环肽和均环肽，全部由氨基酸组成并且严格按照肽键成环的称均环肽；主链由肽键组成，而以其他官能团（如二硫键、酯键、醚键、硫醚键等） 成环，以及含非氨基酸组成的假肽称为杂环肽[8]。亚麻籽环肽是一组存在于亚麻籽和根茎中的疏水性环型植物肽，由8～9 个氨基酸组成，使得其分子量近似1 kDa。但不同品种的亚麻籽中环肽的含量差别很大，可能是受到基因型的影响，也可能与环境因素有关[6]。Oyunchimeg S 等人[9]的研究表明，环肽作为一种抗氧化剂可提高亚麻籽油的稳定性，也可被看作是促氧化剂，这取决于浓度和当时所处的环境。He G 等人[10]研究了亚麻环肽B3及其类似物对人类恶性疟原虫的生存抵制作用。江紫琦[11]的研究表明，传统的Folin -酚法不适用于环肽的定量。当环肽含量在0～200 μg/mL 内，不管紫外检测波长是500 nm 还是745 nm，用该法测得的环肽浓度和吸光值没有良好的线性关系。考马斯亮蓝法测定环肽含量，检测波长为595 nm，环肽在0～20 μg/mL 及20～200 μg/mL 的质量浓度内，所得回归方程线性关系良好（R2分别为0.99 和0.999）。该法操作简便快捷、稳定性好，可用于快速测定环肽含量。HPLC 法测环肽含量，环肽含量在0.5～8.0 mg/mL内，所得标准曲线呈良好线性（R2=0.99）[12-13]。研究利用凯氏定氮法测定总蛋白，考马斯亮蓝法提取蛋白，高效液相色谱法检测蛋白及利用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测亚麻籽环肽的抑菌性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干燥的亚麻籽、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、1 mol/L 的氢氧化钠、1 mol/L 的氯化氢、85%的磷酸、硫酸、五水硫酸铜、硫酸钾、正己烷、果胶酶、Tris-HCl 缓冲液、4%硼酸、考马斯亮蓝G250、牛血清白蛋白、乙醇、甲醇、乙腈、氯化钠、琼脂粉、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、BCA 试剂盒。

1.2 仪器与设备

精密电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；电子计价秤，永康市永州衡器有限公司产品；高效多功能粉碎机，上海市久品工贸有限公司产品；磁力搅拌机，北京卓信宏业仪器设备有限公司产品；电热鼓风干燥机，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司产品；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；40 目、80 目筛，浙江上虞市五四仪器筛具厂产品；pH 计，山东新华医疗器械股份有限公司产品；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产品；低速离心机，安徽嘉文仪器设备有限公司产品；电冰箱，青岛海尔股份有限公司产品；超低温冰箱，美国热电公司产品；冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；紫外分光光度计、高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技公司产品；酶标仪，美国PE 公司产品；全自动凯氏定氮仪，北京盛科信德科技有限公司产品；0.45 μm 滤膜，天津津腾产品；蠕动泵，保定申辰泵业有限公司产品；全自动高压灭菌锅，厦门致微仪器有限公司产品；超净试验台、恒温振荡器，北京东联哈尔滨仪器制造有限公司产品。

2 试验方法

2.1 亚麻籽样品的前处理

2.1.1 脱胶处理

（1） 温水脱胶。称取50 g 亚麻籽，用自来水冲洗干净后，按照1∶6 的料液比向其中加入温水，在磁力搅拌器上以转速1 500 r/min，50 ℃下持续搅拌，至温水黏稠、且转子不能够带动亚麻籽快速转动时更换温水，直至亚麻籽搅拌一段时间后溶液不出现黏稠状态，即脱胶完毕，将脱胶后的亚麻籽置于电热鼓风干燥及中烘干，称量。

（2） 酶法脱胶。称取2 份亚麻籽，每份质量50 g。第1 份亚麻籽按照1∶6 的料液比向其中加入蒸馏水，使用1 mol/L 的氢氧化钠溶液和1 mol/L 的氯化氢溶液调节溶液pH 值到7.0 左右，向其中加入果胶酶1 500 U/g，在34 ℃下水浴加热3 h，在此过程中每隔10 min 搅拌1 次亚麻籽，使其脱胶更加彻底。当加入的蒸馏水黏稠到一定程度时，更换蒸馏水，并且重新调节pH 值至7.0 左右，加入果胶酶，34 ℃下水浴加热。更换3～4 次蒸馏水，当亚麻籽基本不黏手时停止脱胶。将脱胶完毕的亚麻籽置于电热鼓风干燥机中烘干，称量。

第2 份亚麻籽按照1∶6 的料液比加入蒸馏水，使用1 mol/L 的氢氧化钠溶液和1 mol/L 的氯化氢溶液调节溶液pH 值到3.5 左右，向其中加入果胶酶100 U/g，在55 ℃下水浴加热4 h，在此过程中每隔10 min 搅拌1 次亚麻籽，使其脱胶更加彻底。当加入的蒸馏水黏稠到一定程度时，更换蒸馏水，并且重新调节pH 值至3.5 左右，加入果胶酶，55 ℃下水浴加热。直至更换3～4 次蒸馏水，所称取的亚麻籽基本不黏手时停止脱胶。将脱胶完毕的亚麻籽置于电热鼓风干燥机中烘干，称量。

2.1.2 脱脂处理

将脱胶干燥之后的亚麻籽粉碎，过40 目筛，称重。取2 份亚麻籽粉末，每份质量20 g。向第1 份的亚麻籽粉末中按照1∶3 的料液比加入正己烷并静置5 h，再将正己烷和油相倒出，继续按照1∶3 的料液比向其中加入正己烷过夜。弃去正己烷和油相，将脱脂的亚麻籽粉末在36 ℃下水浴加热，除去其中的正己烷，过80 目筛，称量。向第2 份的亚麻籽粉末中按照1∶6 的料液比加入正己烷并静置5 h，再将正己烷和油相倒出，继续按照1∶6 的料液比向其中加入正己烷过夜。弃去正己烷和油相，将脱脂的亚麻籽粉末在36 ℃下水浴加热，除去其中的正己烷，过80 目筛，称量。

2.1.3 亚麻籽粉末中环肽粗蛋白的提取

称取1 g 脱脂脱胶的亚麻籽粉末，按照1∶20 的料液比向预处理的亚麻籽粉末中加入蒸馏水混合均匀。使用1 mol/L 的氢氧化钠溶液和1 mol/L 的氯化氢溶液调整pH 值至10 左右，在48.4 ℃下水浴加热90 min，且期间要经常搅拌使蛋白充分溶解。然后将溶液倒入离心管中，以转速3 000 r/min 离心15 min，得到环肽粗蛋白沉淀。将所得的沉淀物采用上述方法重复浸提1 次，将2 次浸提后得到的上清液合并，再用1 mol/L 的氢氧化钠溶液和1 mol/L 的氯化氢溶液调整pH 值至4.5 左右，使环肽粗蛋白沉淀，再以转速3 000 r/min 离心15 min，倒出沉淀物，并用少量蒸馏水冲洗沉淀3 次，再用1 mol/L 的氢氧化钠溶液和1 mol/L 的氯化氢溶液调整pH 值至7.0 左右，搅拌使环肽粗蛋白重新溶解。将蛋白溶液置于-80 ℃冰箱预冷冻2 h，再转移至4 ℃冰箱过夜，最后进行冷冻干燥24 h，最终得到亚麻籽环肽粗蛋白，称量[14]。

2.2 环肽粗蛋白的测定

2.2.1 凯氏定氮法测定总蛋白

（1） 样品消解。样品粉碎后过80 目筛子，称取样品0.5 g，放入消化管内。分别加入硫酸钾7 g、五水硫酸铜0.2 g、浓硫酸溶液12 mL 后轻摇消化管使其混匀。经4 挡消解仪消化15 min，使蛋白质样品碳化；9 挡下消化60 min 直至样品呈现蓝绿色的澄清透明状态。随后将消化管冷却至50～60 ℃。

（2） 凯氏定氮测定。在测定之前，首先检查氢氧化钠、水和硼酸试剂桶溶液是否足量，然后设置模式为蒸馏方式，蒸馏时间和滴定时间为30 s。每次样品管排空，开始测定，记录数据[15]。

2.2.2 考马斯亮蓝法测定提取蛋白

100 mg 的考马斯亮蓝G-250，体积分数为95%的乙醇溶液50 mL，85%的磷酸溶液100 mL，加Tris-HCl 缓冲液定容至1 000 mL，即得到考马斯亮蓝G-250 染色液。在电子天平上称取12.5 mg 的结晶牛血清白蛋白于小烧杯内，加入少量Tris-HCl 缓冲液溶解后，转移至50 mL 的容量瓶中，用少量Tris-HCl 缓冲液冲洗3 次，将冲洗液倒入容量瓶中，最后用Tris-HCl 缓冲液定容至刻度，配制成标准蛋白溶液，标准蛋白质量浓度为250 μg/mL。称取25 mg的环肽粗蛋白溶解于100 mL 的Tris-HCl 缓冲液配制成样品蛋白溶液。通过检测吸光度测定待测样品的蛋白含量[16]。

2.2.3 高效液相色谱法检测蛋白

首先，称量冷冻干燥的环肽粗蛋白5 mg，溶解于50%的乙腈5 mL 中，配置成质量浓度为1.0 mg/mL的样品溶液；随后样品溶液经0.45 μm 有机系的滤膜过滤后注入待测样瓶中；超纯水和乙腈需提前超声处理1 h 备用。

参考邹仙果[3]和左洋等人[13]关于高效液相色谱法洗脱亚麻籽环肽的方法，试验采用C18分析柱，设置流动相A 相为乙腈、B 相为超纯水，柱温30 ℃，紫外检测波长214 nm，每次进样量10 μL，洗脱流速0.8 mL/min。采用的洗脱梯度为体积分数45%～65%的乙腈溶液（0～25 min），体积分数65%的乙腈溶液（25～45 min），体积分数65%～45%的乙腈溶液（45～50 min）。

2.3 环肽粗蛋白的分离纯化与检测

2.3.1 柱层析法

根据郭其洪等人[17]的方法并稍作修改，向25g 的葡聚糖凝胶G-15 中加入3～4 倍体积的Tris-HCl 缓冲液，浸泡24 h，使葡聚糖凝胶G-15 充分溶胀，使用移液枪除去上层漂浮的凝胶，避免影响洗脱效果。将充分溶胀的葡聚糖凝胶G-15 在120 W 下超声处理1.5 h，使气泡完全逸出。将层析柱用铁架台固定，连接蠕动泵。将脱气的葡聚糖凝胶G-15 使用玻璃棒引流装柱，最好1 次装完凝胶悬液，如果不能，则要在下层凝胶未完全沉淀时向其中2 次加入凝胶悬液，且加入后使用玻璃杯搅拌，在不触碰已经完全沉淀的凝胶前提下将2 次加入的凝胶悬液混匀。装柱过程中避免出现气泡或者断层，装柱后上层界面应保持平整。使用蠕动泵将流速控制在3 mL/5 min，使用Tris-HCl 缓冲液平衡7 个柱体积，流出的溶液pH 值和加入缓冲液的pH 值相近即可。

将提取的环肽粗蛋白配制成5 mg/mL 的溶液（Tris-HCl 缓冲液配置），随即进行过滤，吸取蛋白样品溶液进行上样。静置一段时间后，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，洗脱时的流速为3 mL/5min，每管收集3 mL，在收集9～10 个柱体积后停止。

2.3.2 BCA 法检测蛋白

（1） 蛋白标准品的准备。取1 mL 蛋白标准配制液加入到蛋白标准（20 mg BSA） 中，充分溶解后配制成20 mg/mL 的蛋白标准溶液。取质量浓度为20 mg/mL 的蛋白标准溶液50 μL 稀释至1 mL，得到1 mg/mL 的蛋白溶液，依次将蛋白进行稀释，分别得到0.500，0.400，0.300，0.200，0.100，0.050，0.025 mg/mL的蛋白标准溶液。置于-20 ℃下保存。

（2） BCA 工作液的配制。根据样品数量，按50体积BCA 试剂A 加1 体积BCA 试剂B（50∶1） 配制适量BCA 工作液，充分混匀，配制成BCA 工作液5.1 mL。BCA 工作液室温24 h 内稳定。

（3） 蛋白浓度检测。96 孔板中分别依次加入100 μL 的梯度蛋白标准溶液或洗脱下来的收集液，并向每一个孔中加入100 μL 的BCA 工作液，于60 ℃下孵育30 min，使用酶标仪检测样品在波长562 nm处的吸光度，根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度[18]。

2.4 环肽粗蛋白的抑菌试验

首先配置500 mL LB 培养基（2.5 g 酵母浸粉、5.0 g 胰蛋白胨、5.0 g 氯化钠，加入少量蒸馏水使其溶解，定容至500 mL，调节pH 值至7.2 左右），分为4 瓶。其中，2 瓶中各加入1 mL 的大肠杆菌，其余2 瓶中各加入1 mL 的金黄色葡萄球菌，于37 ℃下以转速180 r/min 恒温振荡培养12 h。将活化的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各吸取1 mL 转移至新的LB 培养基中进行传代培养，于37 ℃下以转速180 r/min 恒温振荡培养12 h。接着称取5，10，15，20，25，30，35 mg 的环肽粗蛋白，分别溶于10 mL的蒸馏水中，配制成不同浓度梯度的环肽粗蛋白。最后配置营养琼脂培养基（蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.5 g，氯化钠2.5 g，琼脂粉7.5 g，定容至500 mL，调节pH值至7.2 左右），灭菌处理。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌稀释至106个/mL，采用滤纸片法做抑菌试验，其中采用生理盐水做空白对照，每组蛋白设置3 组平行，于37 ℃下恒温培养24 h。观察并用直尺用十字交叉法测量其抑菌圈直径，取平均值。

3 结果与分析

3.1 亚麻籽样品的前处理结果

3.1.1 亚麻籽脱胶处理对产品的影响

不同处理方法对亚麻籽脱胶效果的影响见表1。

表1 不同处理方法对亚麻籽脱胶效果的影响

由表1 可知，采用温水脱胶时亚麻籽的粘壁程度相当严重，且在脱胶后干燥耗时较长，亚麻籽颜色较浅，脱胶量为8.43 g；采用1 500 U/g 的酶法脱胶时亚麻籽粘壁程度较轻，且在脱胶后干燥的耗时相对较短，亚麻籽颜色较淡，脱胶量为9.01 g；采用100 U/g 的酶法脱胶时亚麻籽粘壁程度较轻，且在脱胶后干燥耗时短，亚麻籽颜色较深，脱胶量为9.34 g。所以，试验采用100 U/g 的酶法进行脱胶。

3.1.2 亚麻籽脱脂处理对蛋白提取量的影响

不同脱脂处理对亚麻籽蛋白得率的影响见表2。

表2 不同脱脂处理对亚麻籽蛋白得率的影响

由表2 可知，采用1∶3 的料液比进行脱脂，经碱溶酸沉法和冷冻干燥后，所得的蛋白质质量和1∶6 的料液比处理的亚麻籽粉末所得到的蛋白质质量相差不大，但是在蛋白纯度和纯蛋白提取率方面，1∶6 的料液比效果更好。所以，试验采用1∶6 的料液比方法进行亚麻籽的脱脂处理。

3.2 环肽粗蛋白的测定结果

3.2.1 凯氏定氮法结果

（1） 凯氏定氮法测定原理。

（2） 蛋白质含量的计算。

式中：X——样品中蛋白质的百分含量，%；

V1——样品消耗硫酸标准液的体积，mL；

V2——试剂空白消耗硫酸标准液的体积，mL；

N——硫酸标准溶液的当量浓度，%；

0.014——1 N 硫酸标准溶液1 m 相当于氮的克数；

M——样品的质量，g；

F——氮换算为蛋白质的系数。

计算可得在0.5 g 的亚麻籽粉末样品中蛋白质含量约为0.23 g。

3.2.2 考马斯亮蓝法结果

（1） 考马斯亮蓝标准曲线。

考马斯亮蓝标准曲线见图1。

图1 考马斯亮蓝标准曲线

（2） 蛋白质得率计算。由图1 可计算出，样品蛋白的质量浓度为145.8 mg/mL。

3.2.3 高效液相色谱法结果

环肽粗蛋白的高效液相图谱见图2。

图2 环肽粗蛋白的高效液相图谱

参考左洋等人[13]关于亚麻籽环肽分离纯化的研究中亚麻籽粗环肽标准品的高效液相色谱图谱，判断该环肽粗蛋白中含有CLF，CLG，CLC，出峰时间在3～6 min。

3.3 环肽粗蛋白的纯化与检测结果

3.3.1 BCA 标准曲线

BCA 标准曲线见图3。

图3 BCA 标准曲线

3.3.2 分离管的蛋白浓度及分析

分离纯化的蛋白浓度图见图4。

图4 分离纯化的蛋白浓度图

由图4 可知，在洗脱的管子中，前面30 个左右的收集液管是蛋白质含量较高，是由加入的蛋白质中未经过凝胶孔径而直接留下来的混合蛋白质；从第65 个洗脱管到74 个洗脱管中有一个较小的峰值，推测该范围是洗脱下的相对分子量小于1 500 的含有环肽的混合蛋白；在第2 管、第17 管和第50 管中出现蛋白含量激增的情况，推测可能是由于试验操作的失误，导致的蛋白含量大幅度增加。

3.4 环肽粗蛋白的抑菌试验结果

以滤纸片法测定抑菌圈，生理盐水作为空白对照，抑菌圈为0，测定不同质量浓度梯度的环肽粗蛋白对大肠杆菌的抑菌效果。

不同质量浓度环肽蛋白对抑菌结果的影响见表3。

表3 不同质量浓度环肽蛋白对抑菌结果的影响

由表3 可知，对于大肠杆菌而言，较低质量浓度的环肽粗蛋白对大肠杆菌并几乎没有抑菌作用，在质量浓度达到15 mg/mL 时才会出现抑菌效果，且抑菌圈小于5 mm，抑菌效果一般；当环肽粗蛋白浓度达到30 mg/mL 时，对大肠杆菌形成的抑菌圈大于5 mm，抑菌效果为中等。对于金黄色葡萄球菌而言，同样低质量浓度的环肽粗蛋白几乎不产生抑菌效果，只有当环肽粗蛋白的质量浓度达到20 mg/mL 时，才会产生抑菌圈，且抑菌圈的平均直径小于5 mm，抑菌效果一般；只有当环肽粗蛋白的质量浓度达到35 mg/mL 时，才会对金黄色葡萄球菌形成大于5 mm的抑菌圈，抑菌效果为中等。

4 结论

通过对亚麻籽中环肽的研究，结果表明，脱胶脱脂方法都会影响环肽的提取，在100 U/g 酶法脱胶时亚麻籽粘壁程度较轻，且在脱胶后干燥耗时短，亚麻籽颜色较深，脱胶量为9.34 g。采用1∶3 的料液比所得的蛋白质质量和1∶6 的料液比处理的亚麻籽粉末所得到的蛋白质质量相差不大，但是在蛋白纯度和纯蛋白提取率方面，1∶6 的料液比效果更好。试验通过2 种不同的方法测定蛋白质，得出凯氏定氮法在0.5 g 的亚麻籽粉末样品中蛋白质含量约为0.23 g，考马斯亮蓝法得出环肽粗蛋白的提取率为64.9%，提取的蛋白纯度为58.32%。此外，试验通过HPLC 对环肽蛋白进行测定，得出提取的环肽粗蛋白中含有氧化的环肽，并对提取出的环肽粗蛋白采用了柱层析法进行分离纯化，证明了成功分离出环肽。同时，对提取的环肽粗蛋白进行了抑菌试验的验证，发现环肽粗蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有一定的抑菌作用，且对大肠杆菌的抑菌作用比金黄色葡萄球菌的抑菌能力强。目前，对于亚麻籽环肽的制备、抑菌效果等方面的研究还不够深入，所以，优化亚麻籽的制备工艺对深入发展亚麻籽产业具有十分重要的意义。