郭巨先， 欧阳碧珊， 李桂花*， 符梅， 罗文龙， 骆善伟， 陆美莲

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所，广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州 510640；2.仲恺农业工程学院，广州 510225）

菜薹（心）（Brassica parachinensisBailey）是十字花科芸薹属一、二年生草本植物，为我国华南地区的特产蔬菜之一，其风味佳、口感好、适应范围广，在湖南、江西、浙江、福建、北京、上海等地都有较大面积的种植[1]。菜心生长周期较短，有早、中、晚熟等多种类型，每年可以生产9～10茬，复种指数高，可以周年生产[2]。在生产过程中为了实现高产，农民多采用过量施用化肥的生产模式。研究表明，长期连作会导致土壤地力下降、病虫害严重、土壤酶活性降低、微生物环境恶化和作物品质下降等一系列连作障碍问题[3-4]。蔬菜连作3 年以上会以每年10%～20%的速度减产，抗逆性也会降低，病虫害更加严重[5-6]。生产上常常采用水旱轮作、多种作物轮作、间作等多种栽培模式来减少连作障碍的发生，增施有机肥和根际促生菌也是预防连作障碍的有效途径[7-8]。研究表明，通过施用微生物菌肥，可以改善土壤的微生态环境，减少作物的发病率，提高作物的产量和品质[9-12]。刘沙沙等[13]研究发现，有机肥替代75%的化肥可提高上海青产量、品质和氮磷肥利用率。Gao 等[14]研究表明，增施鸡粪和玉米秸秆等有机肥可以改善土壤微生物群落的结构和功能，增强辣椒的抗病能力，降低土传病害。柳玲玲等[15]研究表明，施用生物有机肥对土壤养分和微生物群落结构及马铃薯的农艺性状、出苗率、产量和薯块品质均有改善。此外，雷菲等[16]研究发现，增施有机肥和减施化肥能显著增加种植番茄土壤的有机质含量，提升土壤pH，改善土壤微生物环境，提高番茄的产量和品质。可见，施用微生物有机肥或有机肥与化肥合理配施对提高肥料利用率、改善根际土壤环境、促进植物生长和提高其产量与品质具有重要意义。然而，关于微生物有机肥在菜薹上应用效果的研究相对较少，对于施用微生物有机肥对菜薹连作的根际土壤影响的研究还未见报道。本文以‘粤薹1 号'菜薹为材料，研究不同施用量微生物有机肥对连作菜薹生长、品质、根际土壤的理化性质和微生物多样性的影响，通过分析微生物有机肥对连作菜薹相关生长和营养指标、土壤根际的相关酶活性和生物多样性的影响，确定合理的微生物有机肥施用方案，为连作菜薹种植生产中科学施用微生物有机肥、减少化肥用量、提高肥料利用率、改善土壤环境、解决连作障碍问题和避免农田二次污染以及提高菜薹产量和品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在广东省农业科学院白云试验基地进行，试验地前茬作物为菜薹，供试土壤为沙壤土，土壤初始性质：pH 6.37，有机质25.42 g·kg-1，碱解氮89.26 mg·kg-1，有效磷105.05 mg·kg-1，速效钾295.5 mg·kg-1。

1.2 试验材料

试验品种‘粤薹1 号'菜薹由广东省农业科学院蔬菜研究所提供。微生物有机肥（以下称有机肥）由四会绿参林农业发展有限公司提供，N+P2O5+K2O≥5%，有机质含量≥70%，pH 7.5。复合肥为挪威复合肥，由广州市绿合益农资连锁有限公司提供(N∶P2O5∶K2O=15%∶15%∶15%)。

1.3 试验设计

试验设置T1、T2、T3、T4和对照（CK) 共5个处理，T1:有机肥3 000 kg·hm-2+复合肥225 kg·hm-2；T2:有机肥4 500 kg·hm-2+复合肥150 kg·hm-2；T3:有机肥6 000 kg·hm-2+复合肥75 kg·hm-2；T4:有机肥7 500 kg·hm-2；CK：复 合 肥300 kg·hm-2（详 见表1）。所有肥料分4次施入。每个处理设置3次重复，每小区面积20 m2，随机区组排列。于2021 年3 月10 日播种育苗，4 月2 日定植，4 月28 日在抽薹期采用五点取样法取样，分别测定菜薹的株高、薹长、单株质量、主薹质量和常规营养指标；并采集根际土壤2 份，用冰盒带回实验室，1 份在室内自然风干后测定土壤酶活和土壤肥效指标；另1份直接测定土壤微生物数量，同时取CK和T4处理的土壤送百迈克生物科技有限公司测定土壤微生物多样性。

表1 施肥方案Table 1 Treats of fertilizer （kg·hm-2）

1.4 测定方法

1.4.1 植株生长指标与营养指标的测定 菜薹生长指标的测定：株高、薹长用卷尺测量，单株质量以及主薹质量用电子天平测定。

常规营养指标的测定：维生素C 含量采用2,6-二氯靛酚滴定法测定；还原糖含量采用直接滴定法测定；蛋白质含量采用分光光度法测定；粗纤维含量采用纤维测定仪进行；可溶性固体物含量采用折射仪法测定[17]。

1.4.2 土壤化学性质的测定 土壤pH采用pH计法测定；有机质采用重铬酸钾容量法测定；碱解氮含量采用扩散吸收法测定；有效磷含量采用碳酸氢钠浸提-硫酸钼锑抗比色法测定；速效钾含量采用火焰光度计法测定；电导率（electrical conductance，EC）采用电导仪（土水比1∶5）测定[18]。

1.4.3 根际土壤酶活性的测定 采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照试剂盒的使用方法测定土壤酶活性。采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定脲酶活性；采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性；采用紫外分光光度法测定过氧化氢酶活性；采用磷酸苯二钠比色法测定酸性磷酸酶活性[4,19]。

1.4.4 根际土壤微生物数量的测定 参照《土壤微生物研究原理与方法》[19]，采用稀释涂布平板计数法对细菌、真菌和放线菌的数量进行测定。

1.4.5 土壤微生物多样性的测定 土壤微生物的多样性分析委托北京百迈克生物科技有限公司进行，样品收集后液氮冷冻保存，采用Trizol 法提取样品DNA，并用Illumina Novaseq 6000 平台，对细菌的16S 区进行高通量测序。对测序得到的 Raw reads 通过Trimmomatic v0.33 软件进行过滤；用cutadapt 1.9.1 软件识别并去除引物序列，得到Clean reads。每个样品的Clean Reads 通过Usearch v10 软件进行拼接并对拼接后数据进行长度过滤。使用UCHIME v4.2软件鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。基于可操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）和扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）等特征的分析结果，对样本进行分类分析，得到相应的丰度分布信息。

中心数据显示，目前中心日间手术床位28张，单个手术间单日日间手术最高可达22台。目前，全院共开设七大专科、130多种儿科日间手术，80余种妇科日间手术，这些手术使患者等待时间缩短了50%以上，住院时间由原来2～3天缩短为4～6小时。

1.5 数据统计分析

数据的方差分析和相关性分析采用 SPSS 22.0 软件，利用QIIME2 分析微生物样本的Alpha多样性。

2 结果与分析

2.1 有机肥对菜薹植株生长的影响

如表2 所示，施用有机肥后，T1～T4 处理的菜薹单株质量分别比CK 显著增加了36.56%、22.80%、68.01%、93.67% (P＜0.05)。T2、T3、T4 处理的主薹质量与CK 相比存在显著性差异，分别增加了19.28%、69.18%、104.96%(P＜0.05)，以T4处理下菜薹的单株质量和主薹质量最大。

表2 不同有机肥施用处理下菜薹植株的生长情况Table 2 Growth of Chinese flowering cabbage under different fertilization treatments

2.2 有机肥对菜薹营养品质的影响

如表3 所示，与CK 比较，T4 处理增加了菜薹的维生素C、还原糖、蛋白质、粗纤维及可溶性固体物含量，分别增加了6.28%、0.84%、12.39%、5.30%、37.38%，除还原糖外其他营养指标均与CK有显著性差异。

表3 不同有机肥施用处理下菜薹的营养品质Table 3 Quality of Chinese flowering cabbage under different fertilization treatments

2.3 有机肥对连作菜薹根际土壤化学性质的影响

不同有机肥施用处理下菜薹根际土壤化学性质见表4，土壤有机质、碱解氮含量和电导率随着有机肥施用量的增加而增加，其中T4处理下各指标均最高；与CK 相比，T4 处理的有机质、碱解氮含量和电导率分别显著增加59.67%、97.63%和175.76%。有效磷和速效钾含量随着有机肥施用量的增加呈现先升后降的趋势，T1 处理的有效磷和速效钾含量最高，分别比CK 显著增加80.98%和8.89%。

表 4 不同有机肥施用处理下土壤的化学性质Table 4 Soil chemical properties under different fertilization treatments

2.4 有机肥对连作菜薹根际土壤酶活性的影响

不同有机肥施用处理下菜薹根际土壤酶活性见表5，各施用有机肥处理的脲酶活性均有所降低，酸性磷酸酶和蔗糖酶活性则有所增加，过氧化氢酶变化不大。与CK 相比，T1、T2、T3、T4处理的脲酶活性分别显著降低17.20%、5.19%、5.34%、8.39%；T2、T3 和T4 处理的酸性磷酸酶活性分别显著增加32.24%、18.33%和23.10%；T3 与T4 处理的过氧化氢酶活性分别增加5.15%和7.40%，但差异不显著；土壤蔗糖酶活性随有机肥施用量的增加呈逐渐上升趋势，T1、T2、T3、T4 处理的蔗糖酶活性分别显著增加65.99%、78.48%、91.58%和116.92%。

表 5 不同有机肥施用处理下菜薹根际土壤酶活性Table 5 Soil enzyme activity under different fertilization treatments

2.5 有机肥对连作菜薹根际土壤微生物数量的影响

2.6 有机肥对连作菜薹根际土壤微生物群落多样性的影响

2.6.1 有机肥对连作菜薹根际土壤细菌多样性的影响 为进一步了解微生物有机肥对菜薹根际土壤微生物群落的影响，测定了T4 处理和CK 根际土壤的细菌群落的Alpha 多样性，结果如表7 所示，不施用有机肥的CK 与施用有机肥的T4 处理相比，辛普森指数和香农指数呈极显著差异（P＜0.01）。施用有机肥的T4 处理的香农指数大于没有施用有机肥的CK，说明施用有机肥的土壤细菌的物种种类更多。

表 6 不同有机肥施用处理下菜薹根际土壤微生物的数量Table 6 Microbial populations in soil under different fertilization treatments

表7 土壤细菌群落Alpha多样性指数Table 7 Alpha diversity index of soil bacteria community

2.6.2 有机肥对连作菜薹根际土壤细菌群落物种组成的影响 有机肥处理对细菌群落门水平组成及相对丰度的影响如图1 所示，变形菌门（Proteobacteria）是最丰富的，而酸杆菌门（Acidobacteria）、绿湾菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）依次降低。T4 处理的土壤中优势菌门的相对丰度与CK 存在着显著性差异。施用有机肥后，酸杆菌门（Acidobacteria）和绿湾菌门（Chloroflexi）的相对丰度增加,而变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度降低。

图1 土壤细菌门水平组成及相对丰度Fig. 1 Composition and relative abundance of soil bacteria at the Phyla level

2.6.3 有机肥对菜薹连作根际土壤真菌多样性的影响 由表8 可知，不同有机肥施用处理的土壤真菌群落多样性不同。不施用有机肥的CK 与施用有机肥的T4 处理相比，Chao1 指数、ACE 指数以及辛普森指数均没有显著性差异，而香农指数和覆盖率的差异显著（P＜0.05）。施用有机肥的T4 处理的香农指数大于没有施加有机肥的CK，说明施加有机肥的土壤中物种种类更多。

表8 土壤真菌群落的 Alpha 多样性指数Table 8 Alpha diversity index of soil fungal community

2.6.4 有机肥对连作菜薹根际土壤真菌群落物种组成的影响 将所获的高质量序列在97%相似性水平上进行聚类，共得到860个OTUs，代表序列经物种注释后归属10个门、25个纲、62个目、124个科、258个属、311个种。真菌群落门的水平组成及相对丰度如图2 所示，子囊菌门（Ascomycota）是最丰富的，而壶菌门（Chytridiomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、霉菌门（Mortierellomycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）依次降低。同时可以看到，T4处理的土壤中优势菌门的相对丰度与CK 存在显著性差异，其中，壶菌门（Chytridiomycota）的相对丰度在施用有机肥后显著下降，而霉菌门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度在施用有机肥后显著增加。

图2 土壤真菌门水平组成及相对丰度Fig. 2 Composition and relative abundance of soil fungi at the Phyla level

3 讨论

3.1 微生物有机肥有利于提升连作菜薹的产量和品质

菜薹的单株质量和主薹质量是菜薹植株营养生长的外在表现，也是保证菜薹产量的基础。本试验中，施用微生物有机肥后能够显著提高连作菜薹单株质量及主薹质量，可见施用微生物有机肥对植株的生长大有益处，这与童辉等[20]研究生物有机肥促进了菜薹的生长结果一致。T4 处理可显著提高菜薹维生素C、蛋白质、还原糖、粗纤维和可溶性固形物含量，显著改善菜薹的营养品质，与王冰清等[21]研究化肥减量施用提高了3种蔬菜的可溶性糖、维生素C 和蛋白质含量，降低了蔬菜的硝酸盐含量，从而提高了蔬菜的品质的结果相似。其原因可能是微生物有机肥施入土壤后，其含有的功能菌改善了土壤根际微生物环境，提高根系活力，进而促进根系对营养物质的吸收。

3.2 微生物有机肥有效提升了土壤的肥力和酶活指标

连作容易引起土壤营养失衡[3]。土壤电导率作为土壤理化性质中的基础指标，能够清楚表明含盐量的多少。而土壤溶解性有机质则是土壤微生物生态水平的关键指标之一，可表征容易被土壤微生物直接分解利用的土壤有机质含量的高低。土壤速效钾、碱解氮和有效磷都是反映土壤化学肥力水平的关键指标[21]。本研究表明，增施微生物有机肥减量化肥处理总体上能显著增加菜薹土壤有机质、碱解氮含量和电导率,其中T4 处理的有机质、碱解氮和电导率都是最高的。可见施用微生物有机肥对提高土壤肥力具有较好的作用，由于有机肥自身含有有机质和有益微生物菌，施入土壤后在提高碳源的同时，微生物分解产生的酸类物质也可促进土壤中无效态养分的活化，进而增加土壤中速效养分含量。

土壤酶是一类具有生物催化活性的蛋白质，在土壤中非常活跃，不仅可以分解大分子物质，还可以参与腐殖质的生成，土壤酶的活性可以直接反映土壤的代谢功能,是土壤健康的重要指标[22-24]。本研究表明，与CK 相比，微生物有机肥处理总体上能显著提高土壤酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，而脲酶活性则明显下降。磷酸酶能够活化有机磷，在植物吸收磷元素方面发挥着重要作用。本试验结果与Yang 等[23]研究认为化肥与有机肥配施生物炭后显著提高了碱性磷酸酶活性的研究结果类似。本试验中增施微生物有机肥对脲酶活性产生了抑制作用，这与王一昭等[24]研究生物有机肥能显著提高小白菜土壤脲酶活性的结果相反，可能与试验地立地条件、土壤性状以及有机肥种类不同有关。综合分析，微生物有机肥可提高菜薹连作的根际土壤酶活性，其中以T4处理的效果最佳。

3.3 根际土壤微生物群落多样性对微生物有机肥的响应机制

土壤微生物群落结构受到农田施肥管理措施的影响，不同的施肥措施通过改变土壤 pH，碳、氮和磷等含量直接或间接地影响土壤微生物活性、数量和结构。土壤微生物作为土壤的重要组成成分，其中细菌数量较多，放线菌和真菌数量较少。研究表明，有机肥料的合理施用，可提高土壤细菌数量、调整土壤微生物群落结构，土壤中细菌数量的增加有利于土壤养分的转化，能为植物的生长提供良好的环境，而土壤中放线菌数量的增加不仅能转化土壤有机质，对植物的土传病原菌也起到一定的拮抗作用，可促进土壤微生物区系向健康方向发展[25-28]。Yang 等[23]研究表明，施用加拮抗菌多粘类芽胞杆菌和哈茨木霉菌的腐熟堆肥提高了香蕉根际土壤细菌和放线菌的数量，并提高了植株的抗病性。Zhou 等[28]研究表明，微生物菌肥接种提高了太白凤仙根际土壤酶活性和微生物总数。本研究表明，微生物有机肥处理能增加菜薹根际土壤细菌、放线菌和真菌数量，T4 处理下各指标都达到最大值，可见，化肥减量配施微生物有机肥对菜薹连作土壤的微生物区系的调控作用更为显著，这可能是因为微生物有机肥为土壤微生物提供了更为丰富的碳源、氮源以及大量有益微生物，创造了一个营养充裕的土壤微生态环境，使土壤微生物区系发生变化。其中，以T4处理提高细菌和真菌数量效果最佳，说明大量微生物有机肥的施用提供的养分满足了土壤微生物代谢活动的需要，同时缓解了土壤不适宜的酸碱度对微生物的影响，此外，有机肥的施用量较高也相应地向土壤中输入了较多的外源微生物，在一定程度上起到了“接种”的作用。

对CK和T4处理土壤的分析表明，施加微生物有机肥可以显著增加土壤细菌和真菌物种种类，改变物种丰度。在门分类水平上，各处理土壤真菌的种类远远小于细菌。这与安详瑞等[9]研究显示施用微生物有机肥能够同时提高根际土壤细菌和真菌的丰富度及多样性，而羊粪处理则提高了根际土壤的细菌多样性和真菌丰富度的研究结果相似。另外，在门分类水平上，土壤细菌、真菌群落和优势物种的组成基本相同，但是相对丰度存在一定差异，细菌中的优势菌落酸杆菌门（Acidobacteria）和绿湾菌门（Chloroflexi）在施加有机肥后相对丰度增加, 而变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度降低,真菌中的优势菌落壶菌门（Chytridiomycota）在施加有机肥后相对丰度显著下降，霉菌门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota)在施用有机肥后相对丰度显著增加，但是施加微生物有机肥对于土壤长期的肥效、土壤酶活性、微生物种群数量、微生物活性以及菜薹生长之间的关系还有待深入研究，不同种微生物有机肥对菜薹连作生产的影响也有待进一步研究。

本研究结果表明，施用微生物有机肥可以改进土壤肥力，增加土壤微生物的多样性并且有助于连作菜薹产量与品质的提升，其中以T4处理的效果最好，结果对于缓解连作菜薹的连作障碍以及科学使用微生物有机肥、减少化肥施用、避免农田二次污染提供了理论参考。