郭胜微， 边思文， 丁建文， 张晓辰， 杨兴， 杜锦*， 向春阳*

（1.天津农学院农学与资源环境学院，天津 300392； 2.天津中天润农科技有限公司，天津 300000）

糯玉米是玉米第9 号染色体wx基因发生隐性突变后，直链淀粉含量显著降低的特殊类型玉米[1]。与普通玉米相比，糯玉米胚乳中均为支链淀粉，具有独特的口感和丰富的营养价值，可用于鲜食、轻工业等[2]。据中国种子协会统计，我国糯玉米种植面积已由21 世纪初的不足7 万hm2发展至80万hm2左右[3]。

低温胁迫是一种常见的非生物胁迫。受环境影响，全球气温波动较大，对世界各国作物生产均造成严重的损失和危害[4-5]。玉米是典型的喜温C4作物，各生长阶段对低温都很敏感，最适宜的萌发温度为25 ℃，若温度过低则会降低种子发芽势、发芽率和活力指数等，干扰种子正常萌发[6]。此外，低温会造成活性氧大量积累[7]，引发代谢紊乱[8]，造成出苗率差、生长缓慢、生育期延迟等现象，影响作物的品质和产量[9]。我国东北及华北地区糯玉米种植面积大，品种繁多，为了获得更高的经济效益，种植者更倾向于早春提前播种，这样会造成糯玉米的萌发期正值气温较低的时节，容易遭受倒春寒影响，因此耐低温糯玉米品种的筛选尤为重要。

当前对糯玉米萌发期耐低温评价并没有统一标准，但单一指标无法全面展示糯玉米种质特性，不能准确反映糯玉米耐低温能力，因此，利用不同分析方式对多项指标进行综合评价以得到客观准确的数据信息尤为重要。当前利用率较高的综合评价方法主要有主成分分析法[10]、隶属函数法[11]、灰色关联分析法[12]和聚类分析等[13]。刘杰等[14]利用主成分分析法对81 个玉米品种萌发期耐冷性进行分析评价，并结合聚类分析将其按耐冷性强弱分为5 类。褚力嘉等[15]结合主成分分析法、隶属函数法和聚类分析法，将13 个测定指标转化为3 个相互独立的综合指标，将20 份玉米材料按萌发期耐冷性强弱划分为3 大类。这种综合评价方法结合多种分析方式，能够更好地反映种质的特性。前人对普通玉米萌发期耐低温能力的研究较为广泛，但关于糯玉米耐低温综合评价方面的报道还比较少，因此，本研究以48 个糯玉米品种为试验材料，以萌发期各指标的相对值作为耐低温评价指标，通过主成分分析法、隶属函数法和聚类分析等对各糯玉米品种的耐低温能力做出准确鉴定和评价，以期为耐低温糯玉米的筛选和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验在天津农学院种子实验室进行，选用48个糯玉米品种作为供试材料（表1）。

表1 48个供试糯玉米品种Table 1 48 tested waxy maize varieties

1.2 试验设计

采用低温发芽试验，糯玉米种子用1.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒20 min，蒸馏水冲洗3 次。随机取100 粒种子均匀摆放于发芽盒中进行标准发芽试验，每个品种4 次重复，恒温培养。其中，低温处理组于12 ℃低温培养20 d；对照组于25 ℃培养7 d，每天记录发芽种子数。发芽试验结束后测定相关指标。

1.3 测定项目与方法

测定项目包括发芽势（germination energy，GE）、发芽率（germination rate，GR）、活力指数（vigor index，Ⅵ）、苗长（seedling length，SL）、根长（root length，RL）、根表面积（root surface area，RSA）、根体积（root volume，RV）、根系数（roots number，RN）、苗干重（seedling dry weight，SDW）和根干重（root dry weight，RDW）。

每天测定种子的发芽数，发芽标准为胚根≥种子长、胚芽≥1/2 种子长。发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数的计算方法参见《种子学》[16]。其中处理组发芽势和发芽率的测定时间分别为第16天和第20天；对照组发芽势和发芽率的测定时间分别为第4天和第7天。

选取有代表性的幼苗10 株，采用刻度尺测量苗长（cm），取平均值；采用WinRHIZO 根系分析系统测定根长(cm)、根表面积(cm2)、根体积(cm3)和根系数(根)；将幼苗和根分别于烘箱105 ℃杀青30 min，80 ℃持续烘干至恒重，测定苗干重(g)和根干重(g)。

采用测定指标的相对值表示耐低温系数(low temperature tolerance coefficient，LTTC)，计算公式如下。

1.4 耐低温综合评价

为减小不同方法间的差异对整体评价结果的影响，通过主成分分析法、隶属函数法和聚类分析对糯玉米品种的耐低温能力进行综合评价。首先利用主成分分析法确定主成分个数，将各指标转化为可以代表多个指标表达信息的综合指标；再利用隶属函数法计算综合评价值（D值），对48 个糯玉米品种的耐低温能力进行综合评价，并进行聚类分析。

其中，Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个综合指标最小值；Xmax表示第j个综合指标最大值；Pj为某主成分j的贡献率。

1.5 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2021 和SPSS 25. 0 软件进行数据的整理和统计分析，利用Origin 2021 软件作图。

2 结果与分析

2.1 48个糯玉米品种耐低温指标的相关分析

对10 个指标的相对值进行相关性分析，如图1 所示。10 个指标间均呈正相关，除相对根系数与相对发芽势和相对苗干重间相关不显著外，其余指标间均呈极显著正相关（P＜0.01）。

图1 低温胁迫下48个糯玉米品种各指标相关性Fig. 1 Correlation of indexes of 48 waxy maize varieties under chilling stress

2.2 48个糯玉米品种耐低温主成分分析

糯玉米萌发期的耐低温能力是复杂的数量性状[17]，受多种因子调控，单一的指标无法准确反映各品种间的差异性。为了更全面地分析糯玉米品种地耐低温性，采用主成分分析法进一步评价。对测定的10 项指标进行抽样适合性检验（Kaiser-Meyer-Olkin，KMO）和巴利特球体检验（Bartlett test），结果（表2）表明，KMO 为0.726（＞0.6），显著性为0.000（＜0.05），因此拒绝巴利特球体检验的零假设。

表2 KMO和Bartlett适合性检验Table 2 KMO and Bartlett compatibility test

各项指标间关联程度较高，适合采用主成分分析法，以特征值大于1 为原则，提取出2 个主成分，累计贡献率达到79.183%（表3）。第1 主成分的特征值为6.477，贡献率为64.766%，代表的主要指标包括相对根干重、相对根表面积、相对根体积、相对根长和相对苗长，可反映低温胁迫下糯玉米的根系生长状态；第2 主成分的特征值为1.442，贡献率为14.417%，代表的主要指标包括相对苗干重、相对发芽率、相对活力指数、相对根系数和相对发芽势，可反映低温胁迫下糯玉米的萌发情况，其中相对根系数对第2 主成分的影响为负向。

设相对发芽势、相对发芽率、相对活力指数、相对苗长、相对根长、相对根表面积、相对根体积、相对根系数、相对苗干重和相对根干重依次为X1～X10，根据表3 主成分特征向量，可得出2 个主成分的得分表达式。

根据Y1和Y2，可得出糯玉米耐低温综合得分模型。

综合得分Y代表了糯玉米的耐低温能力，Y值越大说明该品种糯玉米的耐低温能力越强。

2.3 48个糯玉米品种耐低温隶属函数综合分析

结合隶属函数法进一步对糯玉米耐低温进行综合分析。将2 个主成分的综合评价值，根据公式（2）（3）和（4）计算2 个主成分下的隶属函数值U1、U2及权重和综合评价值（D值）。如表4 所示，2 个主成分下的权重分别为0.818 和0.182。对于第1 主成分来说，‘润彩糯686'的隶属函数值最大，‘润糯597'的隶属函数值最小，说明在第1 主成分下，‘润彩糯686'表现出较强的耐低温能力，而‘润糯597'的耐低温能力较弱。对于第2 主成来说，‘景坡82'的隶属函数值最大，‘润糯622'的隶属函数值最小，说明在第2主成分下，‘景坡82'表现出较强的耐低温能力，‘润糯622'的耐低温能力较弱。计算48 个糯玉米品种的D值，结果（表4）表明，耐低温能力较强的5个糯玉米品种依次为‘润彩糯686'‘景坡82'‘润糯175'‘润糯605'‘天贵糯932'；对低温较为敏感的5个糯玉米品种依次为‘润糯597'‘津糯72'‘津糯69'‘华耐甜糯358'‘津糯711'。

表4 48个糯玉米品种耐低温主成分得分、权重、隶属函数值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties 续表Continued

表4 48个糯玉米品种耐低温主成分得分、权重、隶属函数值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties 续表Continued

表4 48个糯玉米品种耐低温主成分得分、权重、隶属函数值、D值Table 4 Principal component score， weight， membership function value and D value of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties

2.4 48个糯玉米品种耐低温聚类分析

根据48 个糯玉米品种的D值采用系统分类法进行聚类分析，结果（图2）表明，在欧氏距离为5 时，48 个糯玉米品种被划分成耐低温型、较耐低温型、低温较敏感型和低温敏感型4 个类群。其中耐低温型有5 个糯玉米品种，占测定品种的10.42%，包括‘润彩糯686'‘景坡82'‘润糯175'‘润糯605'和‘天贵糯932'，D值变化范围为0.938～0.757；较耐低温型有22 个糯玉米品种，占测定品种的45.83%，包括‘景糯307'‘润黑糯729'‘润黑糯829'‘润甜糯70'和‘润甜糯828'等，D值变化范围为0.709～0.505；低温较敏感型有12个糯玉米品种，占测定品种的25%，包括‘润润糯73'‘润糯197'‘景颇556'‘津糯215'和‘景甜糯1248'等，D值变化范围在0.491～0.356；低温敏感糯玉米品种有9 个，占测定品种的18.75%，包括‘润糯1704'‘润甜糯907'‘津糯69'‘津糯72'和‘润糯597'等，D值变化范围在0.323～0.128。

图2 48个糯玉米品种耐低温聚类分析图Fig. 2 Cluster analysis of low temperature tolerance of 48 waxy maize varieties

2.5 评价耐低温糯玉米品种的回归模型

为更快捷地评价糯玉米品种的耐低温能力，利用回归分析对各指标进行筛选，建立糯玉米耐低温评价的数学模型。将10 个性状的耐低温系数作为自变量， 耐低温综合评价值D值作为因变量，进行逐步回归分析，最终建立回归方程。

方程决定系数R2=0.995，代表回归方程可以很好地反映糯玉米的耐低温能力。在同一条件下，只需测定不同基因型糯玉米的相对根干重（RRDW）、相对苗长（RSL）、相对发芽势（RGE）、相对发芽率（RGR）、相对苗干重（RSDW）和相对根表面积（RRSA） 6个指标，利用方程便可估算出D值大小，对糯玉米品种耐低温能力进行准确评价。

3 讨论

萌发期是糯玉米对低温胁迫十分敏感的阶段[18]，低温胁迫会降低种子发芽率、发芽势，出现种子萌发和出苗缓慢、幼苗活力减弱等不良影响[19]。前人对普通玉米低温胁迫的一些研究将处理组温度设置为10 ℃[14,20]，Mohamed 等[21]采用日间温度为10 ℃、夜间温度为4 ℃对玉米进行处理，结果表明ZmPgb1.1的过表达会减弱玉米低温胁迫期间活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导的损伤，调节玉米对低温胁迫的抗性。但本研究室通过前期试验发现，10 ℃低温胁迫下很多糯玉米品种出现不萌发或萌发后死亡的现象，说明糯玉米品种在萌发期对低温胁迫较普通玉米更加敏感。因此本试验设置12 ℃为低温胁迫温度。不同糯玉米品种本身的遗传特性不同，各品种的耐低温能力存在差异[22]，随着糯玉米育种的快速发展，我国已积累大量的糯玉米种质资源，为简便且准确地分析筛选出在萌发期耐低温较强的糯玉米种质，客观系统的耐低温评价体系尤为重要。

前人对不同作物萌发期耐低温评价指标的选择虽有不同，但主要集中在发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数等种子萌发指标[23-24]，对根系指标鲜有关注。实际上根系性状与作物耐低温能力密切相关，Zhao 等[25]通过综合脂质组学和转录组学分析，探讨了低温胁迫下玉米幼苗根系膜脂代谢的变化，结果表明磷脂酰胆碱作为根系膜脂的主要成分，低温胁迫下其含量降低了10%左右；Hund 等[26]研究表明，低温胁迫下根的长度和直径呈负相关，与发芽指数也呈负相关。以上研究表明根系性状与低温胁迫密切相关，因此，本研究在萌发指标的基础上增加了根系性状，且主成分分析也表明第1 主成分即为根系生长因子，是糯玉米耐低温鉴定指标的重要组分。为了更客观地评价作物抗逆性，前人一般采用多个指标作为综合指标后对材料作出评价，避免单一指标的局限性。张陇艳等[27]研究认为，棉花耐低温评价应以芽鲜重、芽干重、活力指数、平均发芽速度和平均发芽时间作为测定指标；王丽艳等[28]认为对水稻萌发期的耐低温评价应以发芽势、发芽率、发芽指数、株高、根干重、根表面积和根体积作为测定指标；而黄贺等[23]认为单项指标的评价结果同隶属函数法得到的耐低温综合评价结果相统一。综上所述，前人对不同作物萌发期的耐低温评价最优指标存在差异，说明不同作物间对低温胁迫的响应存在一定差异。本研究通过对糯玉米萌发期的10 个耐低温相关指标进行主成分分析，提取出2 个主成分，将其命名为根系生长因子和种子萌发因子；再通过回归分析对各指标进行筛选，得糯玉米耐低温评价模型（公式8）：即相同条件下测定糯玉米的相对根干重（RRDW）、相对苗长（RSL）、相对发芽势（RGE）、相对发芽率（RGR）、相对苗干重（RSDW）和相对根表面积（RRSA）6个指标，然后将其代入方程，即可对糯玉米的耐低温能力做出预测和评价。

主成分分析法有降维和简化数据结构的作用，同时可避免人为主观因素的影响[29]。隶属函数法利用模糊数学的原理，以运算后的综合评价值对测定材料进行分析与评价，极大限度地减小误差[30-31]。合理联合多种方法对指标分析，从而尽可能地消除差异，提高数据表达的准确性和客观性[32]。近年来，越来越多的学者对不同作物在各类非生物胁迫下的抗性进行了鉴定与评价，吴奇等[33]利用主成分分析和聚类分析，将54 份高粱品种按抗旱性强弱分为4 类；李红宇等[34]结合主成分分析、隶属函数分析、回归分析和聚类分析等多种方法，对50 份北方粳稻品种的耐盐碱性进行评价。目前对作物抗性的鉴定评价体系并未统一，总体来看分析方式已从单一的分析逐步发展为利用多种分析方法的综合评价，降低了单一评价的片面性和差异性，其鉴定评价结果也更为客观准确。