王 月 梅 慧

(湖北文理学院附属医院,襄阳市中心医院中医科,湖北省襄阳市 441021)

糖尿病肾病是一种以肾微血管病变为主要特点,以蛋白尿、水肿为主要临床表现的糖尿病常见并发症。约有20%的糖尿病患者会并发糖尿病肾病,疾病晚期可出现肾衰竭[1]。糖尿病肾病发病机制复杂,目前认为,大量糖基化终末产物堆积于肾小球是糖尿病肾病发生的关键,且炎性因子及组织纤维化等因素均参与发病,控制纤维化进程可有效延缓病情进展[2]。糖尿病肾病是由多种炎症介质和炎症反应共同参与的慢性炎症性疾病[3],Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的活化可以促使肾间质发生纤维化和肾小球系膜细胞迅速扩增[4],因此,抑制Wnt/β-catenin信号通路可以有效改善糖尿病肾病导致的足细胞损伤。中医认为,糖尿病肾病是各种病邪伤及肾脏所致,以脾肾阳虚型多见[5]。通络益肾温阳方具有益气生津、祛浊解毒、化瘀通络的功效,治疗糖尿病肾病有独特优势[6]。本研究基于Wnt/β-catenin信号通路和炎症探讨通络益肾温阳方通过对糖尿病肾病大鼠的干预机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:清洁级无特定病原体级SD雄性大鼠60只,鼠龄8周,体质量(200±20) g,购自湖北省武汉市新洲区万千佳禾实验动物养殖场[实验动物许可证号SYXK(鄂)2019-0003]。将所有大鼠置于自然光照、室温、55%湿度的环境适应性饲养7 d后开始实验。

1.1.2 实验试剂:通络益肾温阳方由炙黄芪30 g、熟地黄30 g、山茱萸15 g、山药15 g、泽泻12 g、茯苓12 g、桃仁12 g、酒大黄10 g、水蛭3 g组成,药物经常规煎煮过滤,浓缩至每毫升含生药1.438 g,置于4 ℃冰箱备用。试剂包括链脲佐菌素(Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司,批号:S1030),血清肌酐测定试剂盒(碧云天生物科技有限公司,批号:C0105),血清尿素氮测定试剂盒(Affinity公司,批号:df7502),肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) 、转化生长因子β1 (transforming growth factor β1, TGF-β1)ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,批号:262305、CSB-E04725h),TRIzol试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,批号:20181109),反转录试剂盒(上海近岸科技有限公司,批号:E047)。

1.1.3 仪器:OneTouch Ⅱ 型血糖仪及配套试纸(Bio-Rad公司),RM 2135型轮转型切片机(上海徕卡仪器有限公司),AU5821型全自动生化分析仪(Beckman Coulter Life Science公司),BX53型光学显微镜(OLYMPUS公司),BV-2型垂直电泳仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及分组:将60只大鼠随机分为对照组、模型组和观察组,每组20只。取模型组和观察组大鼠,在禁食12 h后单次腹腔注射大剂量(55 mg/kg)链脲佐菌素建立糖尿病肾病模型,72 h后检测空腹血糖及尿蛋白,空腹血糖>16.7 mmol/L且24 h尿蛋白>30 mg则判定为建模成功(40只大鼠均造模成功)。观察组建模成功后第2天给予通络益肾温阳方灌胃10 mL/(kg·d),分早晚2次服完;对照组和模型组则给予0.9%生理盐水灌胃,用法用量同观察组。3组均干预4周。

1.2.2 血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白的检测:干预4周后,抽取大鼠空腹尾静脉血4 mL,分成两份。取其中一份血液样本,离心(3 000 r/min,5 min,离心半径15 cm)后取上清液,采用全自动生化分析仪检测血清尿素氮、肌酐水平;取另一份血液样本,采用OneTouch Ⅱ 型血糖仪及配套试纸检测空腹血糖水平。收集24 h尿液,充分混匀,取5 mL尿液,离心(1 500 r/min,5 min,离心半径10 cm)后取上清液,ELISA测定24 h尿蛋白水平。

1.2.3 血清炎症因子的检测:干预4周后,抽取大鼠空腹尾静脉血2 mL,离心(2 000 r/min,15 min,离心半径18 cm)后取上清液,采用ELISA检测血清TNF-α、TGF-β1水平。

1.2.4 体重及肾重的测量:干预4周后,用电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司,型号:A2013)称量大鼠体重。然后采用颈椎脱臼法处死大鼠,摘取大鼠右侧肾脏,去包膜,电子天平称量右肾重量。

1.2.5 肾组织Wnt4、β-catenin的mRNA表达水平检测:取适量肾组织进行研磨,采用TRIzol法提取总RNA,使用分光光度计检测RNA纯度及浓度,将RNA反转录合成cDNA后进行PCR扩增。Wnt4上游引物序列为5′-GAGAAGCGGGAGTCTGAAAGG-3′,下游引物序列为 5′-GTCACAGGTGTAACGGTAGGTAATG-3′;β-catenin上游引物序列为 5′-GGTCAGCTGCTGTCTCACAT-3′,下游引物序列为 5′-CCCATGTCTCCAAGG GCATT-3′;β-actin(内参)上游引物序列为 5′-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3′,下游引物序列为 5′-AGGGTCAGGATGCCTCTCTT-3′。反应体系包括cDNA 2 μL、2×Taq Plus MasterMix 10 μL、QN ROX Reference Dye 0.1 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、去离子水补足至20.0 μL。反应条件为94 ℃预变性10 min,94 ℃变性15 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸2 min(33个循环),72 ℃修复延伸7 min。采用2-ΔΔCt法计算Wnt4、β-catenin的mRNA相对表达水平。

1.2.6 肾组织Wnt4、β-catenin的蛋白表达水平的检测:采用RIPA裂解液裂解大鼠肾组织,提取总蛋白,4 ℃下12 000 r/min离心20 min,取上清液,用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。将蛋白溶液按4 ∶1比例加入蛋白上样缓冲液后100 ℃变性5 min。通过SDS-PAGE分离等量蛋白,将蛋白转至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温下封闭1 h,TBST洗膜2次,5 min/次,加入Wnt4(1 ∶1 000)、β-catenin(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)一抗(均购自Proteintech公司,批号:AB91226、00018600、10011066)各1 μL,4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次,5 min/次,加入0.9 μL辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶2 000)室温孵育1 h,ECL法显色,使用 Image J软件分析条带灰度值,目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。

1.2.7通络益肾温阳方主要活性成分的筛选:通过中药系统药理学数据库与分析平台(https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索通络益肾温阳方主要中药(山茱萸、山药、炙黄芪、熟地黄)的活性成分,将口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、药物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18作为筛选条件,筛选出主要活性成分。

1.2.8通络益肾温阳方中关键活性成分与β-catenin的分子对接分析:选取β-catenin作为受体,山茱萸、山药、炙黄芪、熟地黄主要活性成分中OB最大的成分(关键活性成分)作为配体,进行分析对接分析。从UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)下载β-catenin的晶体结构,序列号为1LUJ,分辨率为2.50Å,运用YASARA分子模拟软件去水、加氢质子化和添加缺失原子。在 Cytoscape 3.8.0(https://cytoscape.org/)中使用CytoNCA插件对山茱萸、山药、炙黄芪、熟地黄的关键活性成分进行分析。最后运用PyMOL、AutoDock Vina等软件对受体和配体进行分子对接,测定结合能。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠体重、肾重的比较 模型组和观察组大鼠体重均轻于对照组,肾脏均重于对照组(均P<0.05);观察组大鼠体重重于模型组,肾脏轻于模型组(均P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠体重、肾重的比较(x±s,g)

2.2 3组大鼠血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平的比较 模型组和观察组大鼠血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均高于对照组(均P<0.05);观察组大鼠血清尿素氮、血清肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均低于模型组(均P<0.05),见表2。

表2 3组大鼠血清尿素氮、肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平的比较(x±s)

2.3 3组大鼠血清炎症因子水平的比较 模型组和观察组大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平均高于对照组(均P<0.05);观察组大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平均低于模型组(均P<0.05),见表3。

表3 3组大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平的比较(x±s)

2.4 3组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin的mRNA表达水平的比较 模型组和观察组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin的mRNA表达水平均高于对照组(均P<0.05);观察组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin的mRNA表达水平均低于模型组(均P<0.05)。见表4。

表4 3组大鼠Wnt4、β-catenin的mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.5 3组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin的蛋白表达水平的比较 模型组和观察组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin蛋白表达水平均高于对照组(均P<0.05);观察组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin蛋白表达水平均低于模型组(均P<0.05)。见表5和图1。

表5 3组大鼠Wnt4、β-catenin的蛋白相对表达水平的比较(x±s)

图1 3组大鼠Wnt4、β-catenin的蛋白表达水平的比较

2.6 通络益肾温阳方活性成分的筛选结果 山茱萸的主要活性成分共20个,山药的主要活性成分共16个,炙黄芪的主要活性成分共15个,熟地黄的主要活性成分共2个,见表6。

表6 通络益肾温阳方主要活性成分的筛选结果

2.7 分子对接的分析结果 选取山茱萸中的远华蟾蜍精、山药中的薯蓣皂苷元、炙黄芪中的异黄烷酮、熟地黄中的豆甾醇作为配体。测定上述成分作用于β-catenin的结合能,结果分别为-5.28、-6.40、-5.67、-5.33。见图2和图3。

图2 通络益肾温阳方4个主要活性成分与β-catenin的分子对接2D图

图3 通络益肾温阳方4个主要活性成分与β-catenin的分子对接3D图

3 讨 论

持续蛋白尿、炎症因子水平升高、糖脂代谢紊乱及肾功能下降是糖尿病肾病的主要临床表现[7-8]。蛋白尿的主要病理机制是肾皮质发生过氧化应激,致使肾小球滤过屏障足细胞受损、基底膜裸露[9-10]。糖尿病肾病的发病机制至今还未完全阐明,但近30年以来,糖尿病肾病发生机制的相关研究已取得较大进展[11]。糖尿病肾病的诱发因素较多,各个因素之间往往存在协同或者交互作用[12-13]。其中炎症因子水平升高是糖尿病肾病的典型表现,而Wnt/β-catenin信号通路异常活化也是肾脏疾病的发病机制之一[14-15]。为此本研究以二者作为主要观察指标,探讨通络益肾温阳方对糖尿病肾病的作用机制。

本研究结果显示,模型组和观察组大鼠体重轻于对照组,肾脏重于对照组,而观察组大鼠体重均重于模型组,肾脏均轻于模型组(均P<0.05)。说明糖尿病肾病大鼠的体重下降,肾脏增大、重量增加,而通络益肾温阳方可以改善糖尿病肾病大鼠的体重和肾重。本研究结果显示,模型组和观察组大鼠血清尿素氮、肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均高于对照组,而观察组大鼠血清尿素氮、肌酐、空腹血糖及24 h尿蛋白水平均低于模型组(均P<0.05)。说明通络益肾温阳方能够改善糖尿病肾病大鼠的肾功能、血糖水平,有助于缓解蛋白尿。在糖尿病肾病的发展过程中,TNF-α、TGF-β1等炎症因子表达过高会加重肾组织损伤[14]。本研究结果显示,模型组和观察组大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平高于对照组,而观察组大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平低于模型组(均P<0.05)。说明糖尿病肾病大鼠体内的炎症因子水平升高,而通络益肾温阳方具有降低糖尿病肾病大鼠体内炎症因子水平的作用。

糖尿病肾病纤维化的进展与Wnt和β-catenin蛋白水平升高密切相关[15]。Wnt/β-catenin信号通路异常活化会导致肾脏固有细胞凋亡,造成肾脏组织不可逆性损伤[16]。在高糖环境中Wnt/β-catenin信号通路被激活,导致肾损伤[17]。本研究结果显示,模型组和观察组大鼠Wnt4、β-catenin的蛋白及mRNA表达水平均高于对照组,而观察组Wnt4、β-catenin的蛋白及mRNA表达水平均低于模型组(均P<0.05)。由此推测通络益肾温阳方可以通过降低Wnt4、β-catenin的表达水平,改善由Wnt/β-catenin信号通路激活引起的肾损伤。

糖尿病肾病的原发病是糖尿病,而糖尿病属于中医学“消渴病”范畴。消渴病是一种慢性迁延性疾患,发病初期以阴虚燥热为基本病机。消渴迁延多年,久病发肾,久病入络,本虚标实、肾虚络瘀是糖尿病肾病的病机特点。本虚是指气阴两虚,阴损及阳,阴阳两虚,标实则是在正虚的前提下,血瘀络阻、水饮湿浊等毒邪蕴蓄。通络益肾温阳方(自拟方)是治疗糖尿病肾病的方剂,该方中炙黄芪味甘性温,补气升阳,生津止渴,其提取物黄酮类化合物是天然抗氧化剂,能够抑制脂质过氧化,并可以调节血糖,为君药。山茱萸主入肝、肾经,滋养肝肾以充养先天,山药性平味甘,功能健脾补肺、益肾固精,熟地黄性凉、味苦酸,有养阴润燥生津功效,三药协同,共为臣药,不仅健脾益肾之力显著,而且化瘀通络之效显增,是治疗本虚标实证之核心。通络益肾温阳方以肾气丸合抵当汤去虻虫,加黄芪而成,全方扶正祛邪,消补兼施,具有温阳滋阴、活血通络、益肾泄浊之效,适用于肾亏阴阳两虚、偏于阳虚兼瘀血阻络的糖尿病肾病患者[18]。本研究筛选出有炙黄芪的异黄烷酮、山茱萸的远华蟾蜍精、熟地黄的豆甾醇、山药的薯蓣皂苷元作为配体进行分子对接分析。研究显示,炙黄芪的主要活性成分异黄烷酮在糖尿病肾病大鼠模型中具有改善肾脏高灌注、延缓肾脏病发生、防止蛋白尿的作用[19]。山茱萸中的远华蟾蜍精对正常大鼠的血糖没有影响,但是能降低糖尿病肾病大鼠的血糖水平和尿蛋白水平[20]。山药中的薯蓣皂苷元能够减缓糖尿病肾病大鼠的肾衰竭,降低其血糖及血脂水平,熟地黄中的豆甾醇具有降低糖尿病肾病大鼠的炎性因子、血糖和尿蛋白水平,以及改善肾脏纤维化和足细胞损伤的作用[21]。上述主要活性成分与靶点β-catenin的结合能为负数,说明其结合过程能自发进行;结合能的绝对值较大,表明结合后的亲和作用较强且构象稳定。这进一步提示通络益肾温阳方可能通过这些主要活性成分作用于Wnt/β-catenin通路而发挥治疗作用。

综上所述,通络益肾温阳方可有效改善糖尿病肾病大鼠的肾功能,其可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路及炎症反应,从而减轻肾损伤。