李定桦 连 芳 邬国斌

(1 广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科,广西南宁市 530021;2 广西医科大学基础医学院生理教研室,广西南宁市 530021)

肝细胞癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,具有发病隐匿、易复发、易转移等特点。肝细胞癌极具侵袭性,在所有恶性肿瘤中其发病率和病死率分别位居第6位和第3位[1]。尽管近年来在肝细胞癌的诊断和治疗方面的研究取得了较大进展,但是肝细胞癌患者的预后仍不理想,这可能是由于肝细胞癌发生与发展的分子机制尚未完全清楚,个性化治疗进展困难[2]。目前肝细胞癌的早期诊断较为困难,传统的血清学分子标志物(如甲胎蛋白等)可用于诊断原发性肝细胞癌及评估肝细胞癌患者的预后,但其灵敏度并不理想[3]。醛缩酶B是醛缩酶蛋白家族成员之一,又称果糖-1,6-二磷酸酶B,通常在肝脏、肾脏和肠道细胞中表达[4]。醛缩酶B基因编码醛缩酶B蛋白,该基因缺陷可导致遗传性果糖不耐受[5]。醛缩酶B不仅参与糖酵解过程,而且在果糖的分解代谢途径中也发挥重要的作用[6]。醛缩酶B的异常表达被认为与某些疾病相关,如醛缩酶B缺失会激活胰岛素受体转导促使肝细胞癌变[7];醛缩酶B高表达可引起DNA的碱基切除和错配修复,从而诱导癌细胞凋亡[8];与醛缩酶B高表达的胃癌患者相比,醛缩酶B低表达的胃癌患者病理特征较差,生存时间显著缩短[9]。此外,醛缩酶B还能与HBsAg结合,共同抑制肝癌细胞HepG2的凋亡[10]。但关于醛缩酶B和肝细胞癌之间的关系和分子联系研究仍相对较少,因此,深入探讨两者之间的分子机制等方面对于肝细胞癌的诊疗具有重要意义。本研究通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库、人类蛋白质表达图谱(Human Protein Atlas,HPA)数据库等分析醛缩酶B在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的差异表达情况,并进行生物信息学分析,探讨醛缩酶B与肝细胞癌患者临床特征及预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 醛缩酶B mRNA和蛋白在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的表达 (1)从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov)下载374例肝细胞癌组织和50例正常肝脏组织的RNA测序数据,以及对应的377例肝细胞癌患者的临床资料。将RNA测序数据由FPKM格式转换成TPM格式,并进行对数(以2为底数)转化。采用R软件(版本号:3.6.3)进行非在线数据分析与可视化处理,分析醛缩酶B mRNA在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的表达情况,以P<0.05为差异具有统计学意义。(2)采用HPA数据库(https://www.proteinatlas.org/)检索肝细胞癌组织与正常肝脏组织的醛缩酶B蛋白免疫组化检测结果图片,分析醛缩酶B蛋白在肝细胞癌组织与正常肝脏组织中的表达情况。

1.2 生物信息学分析 利用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)检索与醛缩酶B具有直接相互作用的蛋白,并按SCORE值由大到小进行排序,选取排名前10的蛋白,进行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析及可视化处理。利用基因本体论(Gene Ontology,GO)数据库(http://geneontology.org/)对编码上述蛋白的基因进行GO功能富集分析,包括生物过程、细胞组分、分子功能。利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库(https://www.kegg.jp/)对编码上述蛋白的基因进行KEGG通路富集分析。以|log2FC|>2并且P值<0.05为筛选条件,利用R 3.6.3软件进行可视化处理按校正后P值由大到小排序。

1.3 醛缩酶B mRNA表达量与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性 使用R软件的Kruskal-Wallis检验分析醛缩酶B mRNA的表达量与肝细胞癌患者临床病理特征(性别、年龄、TMN分期、病理学分期、组织学分级和血清甲胎蛋白含量)的相关性。

1.4 醛缩酶B mRNA表达量与肝细胞癌患者预后的相关性 根据醛缩酶B mRNA表达量的中位数将肝细胞癌患者分为高表达组和低表达组,采用Kaplan-Meier法制作生存曲线,使用log-rank检验比较两组患者的生存期;将醛缩酶B mRNA表达量和患者临床特征纳入COX回归模型,分析肝细胞癌患者预后的影响因素,以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.5 醛缩酶B mRNA诊断肝细胞癌的临床价值 使用R软件绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线,分析醛缩酶B mRNA表达量预测肝细胞癌患者预后的效能,曲线下面积(area under the curve,AUC)>0.5且≤0.7时具有较低准确性,AUC>0.7且≤0.9时具有一定的准确性,AUC>0.9时具有较高的准确性。

2 结 果

2.1 肝细胞癌组织和正常肝脏组织中醛缩酶B mRNA表达量的比较 肝细胞癌组织中醛缩酶B mRNA表达量低于正常肝脏组织(P<0.05),见图1。

图1 肝细胞癌组织和正常肝脏组织中醛缩酶B mRNA的表达量

2.2 肝细胞癌组织和正常肝脏组织中醛缩酶B蛋白表达情况的比较 在使用同一种抗体(HPA002198)检测的条件下,醛缩酶B蛋白在肝细胞癌组织中表现为小面积浅棕色,呈弱阳性表达,而在正常肝脏组织中表现为大面积深棕色,呈强阳性表达,说明肝细胞癌组织中醛缩酶B蛋白表达量低于正常组织。见图2。

图2 肝细胞癌组织(左)和正常肝脏组织(右)中醛缩酶B蛋白的表达情况

2.3 生物信息学分析结果 PPI分析结果显示,醛缩酶B与二羟基丙酮激酶、果糖1,6-二磷酸酶1、果糖1,6-二磷酸酶2等10个蛋白直接相互作用,见图3。GO功能富集分析结果显示,编码上述蛋白的基因功能富集在葡萄糖代谢等方面,其中,生物过程以单糖代谢过程、己糖代谢过程、果糖1,6-二磷酸代谢过程为主,细胞组分以转移酶复合物-转移含磷基团为主,分子功能以单糖结合、碳水化合物激酶活性、单磷酸腺苷结合为主;KEGG通路富集分析结果显示,这些基因所参与的信号通路主要富集在糖酵解/糖异生、碳代谢、果糖和甘露糖代谢等方面,见图4。

图3 PPI网络图

图4 GO/KEGG富集分析气泡图

2.4 醛缩酶B mRNA表达量与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性 不同TNM分期、病理学分期、组织学分级、血清甲胎蛋白含量的肝细胞癌患者之间,醛缩酶B mRNA表达量差异均具有统计学意义(均P<0.05),而不同性别、年龄的肝细胞癌患者之间,醛缩酶B mRNA表达量差异无统计学意义(均P>0.05)。见图5。

图5 醛缩酶B mRNA表达量与肝细胞癌患者临床特征的相关性

2.5 醛缩酶B mRNA表达量与肝细胞癌患者预后的相关性 低表达组及高表达组的中位生存期分别为44.984个月和69.869个月,低表达组肝细胞癌患者的中位生存期短于高表达组(χ2=2.525,P=0.008),见图6。COX回归分析结果显示,醛缩酶B mRNA表达量是肝细胞癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)。见表1、表2。

图6 生存曲线

表1 变量赋值表

表2 肝细胞癌患者预后影响因素的COX回归分析结果

2.6 醛缩酶B mRNA表达量预测肝细胞癌患者预后的价值 ROC曲线结果显示,醛缩酶B mRNA表达量预测肝细胞癌患者预后的AUC为0.818(95%CI:0.776,0.859),特异度为88.0%,灵敏度为73.3%,具有一定的准确性。见图7。

图7 ROC曲线

3 讨 论

近年来,生物新陈代谢及代谢组学是生物医学研究的重要内容,越来越多的学者认为细胞和个体的新陈代谢可能导致疾病的发生与发展[11]。糖酵解普遍存在于生物体内及细胞内[12]。研究表明,肿瘤组织中糖酵解导致乳酸分泌增加,进而使局部微环境pH降低,而低pH环境会使基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9及组织蛋白酶B等表达上调,从而利于肿瘤转移[13-14]。代谢重编程被认为是恶性肿瘤的重要标志[15]。有研究表明,醛缩酶B可直接与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶结合并抑制其活性,调节葡萄糖代谢及代谢重编程,从而在肝细胞癌中发挥抑制肿瘤的作用;而醛缩酶B的缺失可通过上调糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环,产生一种新的代谢重编程,促进肝细胞癌的发展[16-17]。

本研究结果显示,醛缩酶B 蛋白和mRNA在肝细胞癌组织中均呈低表达,且在不同TNM分期、病理学分期、组织学分级、血清甲胎蛋白含量的肝细胞癌患者中,醛缩酶B mRNA表达量差异均具有统计学意义(P<0.05);生存曲线结果显示,醛缩酶B mRNA低表达的肝细胞癌患者的中位生存期短于高表达者(P<0.05),且COX回归分析结果显示醛缩酶B mRNA表达量是肝细胞癌患者预后的独立影响因素(P<0.05),这与既往研究结果[18-19]相似。上述结果说明醛缩酶B与肝细胞癌患者的临床病理特征和预后相关,提示醛缩酶B mRNA表达水平越低,肿瘤的恶性程度越高,患者预后越差。

本研究GO功能富集分析和KEGG通路富集分析结果显示,与醛缩酶B直接相互作用的蛋白参与的生物过程以单糖代谢过程、己糖代谢过程、果糖1,6-二磷酸代谢过程为主,细胞组分以转移酶复合物-转移含磷基团为主,分子功能以单糖结合、碳水化合物激酶活性、单磷酸腺苷结合为主,参与的信号通路主要富集在糖酵解/糖异生、碳代谢、果糖和甘露糖代谢等方面。目前有关醛缩酶B和肝细胞癌之间的作用机制研究仍然较少,上述的生物过程、信号通路等有可能是探索两者关系的突破口,也可能成为肝细胞癌的潜在治疗靶点。

综上所述,醛缩酶B蛋白及mRNA在肝细胞癌组织中呈低表达,醛缩酶B mRNA表达量与肝细胞癌患者的临床病理特征及预后密切相关,醛缩酶B mRNA低表达者的肿瘤恶性程度更高,预后更差,其有可能成为诊断肝细胞癌及判断患者预后的新型分子标志物。但本研究只进行了描述性分析,今后仍需进行功能实验进一步探讨醛缩酶B在肝细胞癌中的分子作用机制。