王 骞 李心红

(内蒙古医科大学第一附属医院1 检验科,2 放疗科,内蒙古自治区呼和浩特市 010050)

乳腺癌作为常见的恶性肿瘤之一,其发病率高,已成为危害女性健康的全球性重大问题,早期诊断和精准治疗是降低乳腺癌病死率的重要措施[1]。随着分子技术水平的不断提升,肿瘤相关分子机制成为肿瘤治疗研究的新热点,为临床治疗提供新思路、新线索。细胞分裂周期相关因子(cell division cycle-associated protein,CDCA)是与真核细胞的细胞周期呈同步周期性浓度变化的蛋白,可与依赖性蛋白激酶结合参与细胞周期调控[2]。研究表明,乳腺癌组织及细胞系中存在CDCA基因家族mRNA的表达[3]。CDCA3为细胞有丝分裂始动因子,通过调控细胞周期等途径来参与多种癌症的发生和发展[4]。例如,方兰等[5]发现,CDCA3 mRNA在食管癌组织和细胞系中均呈高表达水平,沉默CDCA3表达可显著抑制食管癌细胞的增殖,促进食管癌细胞的凋亡。另外,研究发现CDCA3的异常表达与胃癌细胞肌层浸润性相关[6]。但目前有关CDCA3在乳腺癌中的研究仍较少。因此,本研究探讨CDCA3在乳腺癌细胞中的表达水平,并分析CDCA3对乳腺癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 MDA-MB-361细胞、CAMA-1细胞、MCF-7细胞、SKBR-3细胞均购于ATCC公司。

1.2 主要试剂和仪器 RIPA试剂盒、1×PBS缓冲液、Annexin Ⅴ- FITC/PI 凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸微量蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号:R0020、P1020、CA1020、PC0050),含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司,货号:PM150110B),LipofectamineTM2000试剂盒、实时荧光定量PCR检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,货号:11668019、11668027),4×Loading buffer(江西艾博因生物科技有限公司,货号:C156),鼠抗人CDCA3多克隆抗体、山羊抗小鼠IgG二抗、GAPDH单克隆抗体、ECL 底物试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司,货号:ABP50936、A21010、ABM40040、KA3725),MTS细胞增殖试剂盒(上海莼试生物技术有限公司,货号:CSX9906),TRIzol试剂盒(Invitrogen公司,货号15596018),Binding buffer(IMMUNOSTEP公司,货号:BB10X),反转录试剂盒(QIAGEN公司,货号:218161)。酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司,型号:Scientific MK3),流式细胞仪(Beckman Coulter Life Sciences公司,型号:CytoFLEX)。si-NC序列、si-CDCA3序列均由上海吉凯基因化学技术有限公司设计,si-NC序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,si-CDCA3序列为5′-GAGUGAAGUAUUUGAAACUTT-3′。

1.3 实验方法

1.3.1 Western blot检测4种人乳腺癌细胞的CDCA3蛋白表达水平:取对数生长期细胞,使用RIPA裂解细胞,振荡器振荡5 min,4 ℃下14 000 r/min离心20 min,采用二喹啉甲酸法测定细胞总蛋白。每个样品取30 μg蛋白,加入5 μL的4×Loading buffer中煮沸,通过SDS-PAGE分离等量蛋白,将蛋白转至PVDF膜。室温滴加脱脂牛奶封闭抗体1 h,TBST溶液冲洗3次,5 min/次,滴加鼠抗人CDCA3多克隆抗体(1 ∶1 000)、GAPDH多克隆抗体(1 ∶5 000),4 ℃孵育过夜。TBST溶液冲洗3次,5 min/次,滴加山羊抗小鼠IgG二抗(1 ∶5 000),室温孵育1 h。使用ECL曝光条带,使用Quantity One 5.0软件进行定量分析,计算目的蛋白灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值比值。上述实验重复3次,结果取平均值。

1.3.2 实时荧光定量PCR法测定4种人乳腺癌细胞的CDCA3 mRNA表达水平:取对数生长期细胞,采用TRIzol法提取细胞总RNA,使用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度,使用反转录试剂盒将RNA逆转录合成cDNA后进行实时荧光定量PCR扩增。PCR反应体系包括SYBR Premix Ex Taq 6.0 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、cDNA 1.0 μL、RNase-Free H2O 4.0 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 s,95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、延伸30 s(共40个循环)。采用2-ΔΔCt法计算CDCA3 mRNA相对表达水平。CDCA3上游引物5′-AAGAGCGTCCCAGTCACAC-3′,下游引物5′-CCAGCACTAGGTGAACGGG-3′,内参GAPDH上游引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。上述实验重复3次,结果取平均值。

1.3.3 细胞培养及转染:(1)细胞培养。将筛选出的人乳腺癌细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基,置于37℃、5%CO2的培养箱培养,待细胞融合度达80%进行传代,取处于对数生长期细胞进行相关实验。(2)细胞转染。将细胞分为空白组、si-NC组、si-CDCA3组,采用无血清培养基稀释si-NC和si-CDCA3序列,室温静置5 min。按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书,分别将si-NC和si-CDCA3序列转染si-NC组和si-CDCA3组,空白组不做处理。室温反应20 min后,加至6孔板内,置于37 ℃、5% CO2的培养箱培养,12～16 h更换培养基为完全培养基,继续培养。转染48 h后,采用实时荧光定量PCR法验证沉默效果。

1.3.4 MTS法检测细胞增殖情况:细胞转染3 d后,弃掉旧培养基,使用PBS溶液洗涤后加入不含乙二胺四乙酸的胰酶消化细胞。将细胞接种于96孔板(1×104个/孔),置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后,每孔加入10 μL的MTS细胞增殖试剂盒溶液,37 ℃孵育1～4 h。使用酶标仪测定490 nm波长处吸光度,细胞增殖抑制率(%)=(si-NC组吸光度-si-CDCA3组吸光度)/(si-NC组吸光度-空白组吸光度)×100%,其中si-NC组吸光度和空白组吸光度取各组的平均值。上述实验重复3次,结果取平均值。

1.3.5 流式细胞术检测细胞周期与凋亡情况:细胞转染3 d后,将细胞密度调整为1×106个/mL后接种于24孔板,1 000 r/min离心5 min后收集细胞沉淀。使用预冷PBS溶液洗涤2次,5 min/次,4 ℃下以75%乙醇固定4 h。1 500 r/min离心5 min,弃上清液,使用PBS溶液冲洗3次,5 min/次,37 ℃、5% CO2培养箱内培养待用。(1)细胞周期检测。加入400 μL的PI染液和100 μL的核糖核酸酶A溶液,4 ℃避光孵育30 min。采用流式细胞仪检测细胞周期情况,采用ModFit软件进行分析。(2)细胞凋亡检测。加入500 μL的Binding buffer、5 μL的PI染液及5 μL的Annexin Ⅴ-FITC溶液,室温避光孵育15 min。使用1×PBS缓冲液冲洗1次(5 min/次)后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,绘制散点图,左上象限为坏死细胞,左下象限为活细胞,右上象限为晚期凋亡细胞,右下象限为早期凋亡细胞,细胞凋亡率为右上象限和右下象限百分率之和。上述实验重复3次,结果取平均值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料用(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CDCA3在乳腺癌细胞中的表达情况 4组细胞株的CDCA3蛋白及mRNA表达水平比较,差异均有统计学意义(均P<0.05),其中MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞的CDCA3蛋白及mRNA表达水平均高于CAMA-1细胞和SKBR-3细胞(均P<0.05),而MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞的CDCA3蛋白及mRNA表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05),故选取MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞进行后续实验。见表1。

表1 4种人乳腺癌细胞的CDCA3蛋白及mRNA相对表达水平的比较(x±s)

2.2 沉默CDCA3基因表达对人乳腺癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响 无论是MCF-7细胞还是MDA-MB-361细胞,空白组、si-NC组、si-CDCA3组细胞的增殖抑制率、G0/G1期比例、凋亡率均依次升高(均P<0.05),见表2和表3。

表2 3组MCF-7细胞的增殖抑制率、G0/G1期比例、凋亡率比较(x±s,%)

表3 3组MDA-MB-361细胞的增殖抑制率、G0/G1期比例、凋亡率比较(x±s,%)

3 讨 论

乳腺癌依然是国内女性发病率最高的恶性肿瘤,5年生存率为82.0%[7]。研究表明,肿瘤细胞具有无限增殖的特性,因此通过调控细胞周期来抑制乳腺癌细胞增殖或许是治疗乳腺癌的有效策略之一[8]。细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始至下一次分裂结束的过程。CDCA是真核细胞细胞周期循环外主要调节因子。研究表明,CDCA可影响肿瘤细胞生长、增殖、转移等多种生物学行为[9]。Shen等[10]发现,CDCA7L在人脑胶质瘤组织中呈高表达,并可增强胶质瘤细胞的侵袭性。CDCA3被认为是细胞进入有丝分裂所必需的蛋白,即进入有丝分裂的触发因子[11]。已有研究证实,CDCA3在多种癌组织中呈高表达,下调CDCA3表达可显著抑制肿瘤细胞生长,并可诱导肿瘤细胞凋亡[12-14]。然而,国内外关于CDCA3在乳腺癌中的作用却鲜有研究报告。

本研究选取4种人乳腺癌细胞进行CDCA3表达水平的检测,其中MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞的CDCA3蛋白及mRNA表达水平均高于CAMA-1细胞和SKBR-3细胞(均P<0.05),与Phan等[15]的研究结果一致,因此选取MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞进行后续实验。Zhang等[16]发现,CDCA3过度表达可刺激胃癌细胞生长和集落形成,并促进小鼠体内异种移植瘤形成,诱导细胞G0/G1期的阻滞。刘芳等[17]发现,肝癌组织CDCA3表达水平高于癌旁组织,且肝癌细胞HepG2、Huh7、SMMC-7721、LO2中CDCA3均呈高表达,下调CDCA3表达可抑制肝癌细胞的增殖。Qian等[18]发现,过表达CDCA3可抑制人大肠癌细胞SW480的增殖,而抑制CDCA3表达可导致SW480细胞在G1/S期的转变停滞,G0/G1期细胞比例显著减少。也有学者发现,在非小细胞肺癌中,CDCA3通过将细胞周期阻滞于G2/M期从而抑制了非小细胞肺癌细胞的增殖[4]。以上研究结果提示,CDCA3在不同的肿瘤组织中发挥的作用及机制存在差异。有研究表明,CDCA3可通过负反馈调控k基因结合核因子信号通路,使肿瘤坏死因子受体相关因子1、肿瘤坏死因子受体相关因子2及核因子κB抑制蛋白α发生相互作用,从而发挥转录抑制作用,抑制相关靶基因的表达[19]。细胞凋亡属于正常生命现象,恶性肿瘤的发生与细胞凋亡异常相关,细胞凋亡在肿瘤的治疗中具有重要意义[20-21]。本研究结果显示,沉默CDCA3表达后,MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞的增殖抑制率增高,G0/G1期细胞比例增加,凋亡细胞增多,表明CDCA3参与乳腺癌细胞的增殖、生长及凋亡过程,CDCA3有可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

综上所述,CDCA3在人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-361中呈显著高表达,沉默CDCA3后,MCF-7细胞和MDA-MB-361细胞的增殖受到抑制,G0/G1期细胞比例及细胞凋亡率增高。CDCA3或可成为乳腺癌治疗的新靶点,但其具体作用机制仍需要进一步探索。